SGT1正調控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性

戎 偉，梅雙雙

（1.海南大學農學院，海南 海口 570228；2.海南大學環境與植物保護學院，海南 海口 570228）

SGT1正調控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性

戎 偉1，梅雙雙2

（1.海南大學農學院，海南 海口 570228；2.海南大學環境與植物保護學院，海南 海口 570228）

通過在擬南芥野生型Col-0和突變體sgt1b、eds1上接種橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106，分析了白粉菌細胞進入率、葉片發病癥狀、菌絲生長狀態、細胞死亡和活性氧產生等表型。結果表明，與野生型Col-0相比，橡膠樹白粉菌在擬南芥sgt1b上激發的早期抗病性、后期抗病性以及抗病反應部分降低，暗示著SGT1在穩定識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白方面發揮著非常重要的作用。

橡膠樹白粉菌；擬南芥；SGT1；抗病性

SGT1 （Suppressor of G-Two Allele of Skp1）是與著絲粒裝配和蛋白泛素化有關的基因，最早在酵母中被發現［4］，在模式植物擬南芥和煙草以及大麥等許多植物中都有發現，且大多數植物包括SGT1a和 SGT1b兩個基因。通過在煙草或擬南芥中進行基因沉默、突變和過表達等試驗表明，SGT1與植物抗性基因介導的抗病反應密切相關［5-11］。SGT1基因沉默或突變會導致一些抗性基因表達下調以及介導的抗性反應消失［6］。反之，SGT1基因超表達會增強植株的抗病能力［8］。最近研究發現，SGT1、RAR1作為HSP90的分子伴侶蛋白，三者在植物體內相互作用，對R蛋白的積累與穩定性具有重要作用［12-13］。

作為HSP90的伴侶蛋白，RAR1參與了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性［3］，但SGT1是否具有RAR1相同的功能目前仍然未知。由于sgt1a和 sgt1b雙突變體擬南芥是致死的表型，因此本研究選擇了sgt1b單突變體，通過在擬南芥野生型Col-0、突變體sgt1b和eds1上接種橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106，進行了白粉菌細胞進入率、菌絲生長抗性、葉片發病癥狀、細胞死亡、活性氧產生及致病相關基因PR1 （Pathogenesis-related gene 1）表達等表型分析，發現SGT1b 參與了橡膠樹白粉菌激活的抗病性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料：橡膠樹73397，擬南芥野生型Col-0，擬南芥突變體eds1［14］，擬南芥突變體sgt1b［15］。

供試菌株：橡膠樹白粉菌Oidium heveae HN1106［3］。

1.2 試驗方法

1.2.1 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性分析 （1）白粉菌細胞進入率計算：利用接種箱接種橡膠樹白粉菌，接種1 d后，剪取葉片置于脫色液（乙醇 20 mL，苯酚 10 mL，H2O 10 mL，乳酸 10 mL）中脫色過夜。將葉片于染色液（考馬斯亮藍 G250，0.6% 乙醇溶液）中染色30 s，顯微鏡觀察，計數擬南芥葉片上含有1根芽管和2根芽管的白粉菌孢子數目［3］，計算白粉菌細胞進入率。

（2）菌絲生長長度分析：接種橡膠樹白粉菌2 d后，剪取葉片置于脫色液中脫色過夜。將葉片于考馬斯亮藍染色液中染色30 s，顯微鏡觀察，利用MIE 3.1軟件分析菌絲生長長度［3］。

1.2.2 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性分析 （1）葉片發病癥狀觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，觀察葉片發病癥狀，拍照。

（2）菌絲生長狀態觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于脫色液中脫色過夜。將葉片在考馬斯亮藍染色液中染色30 s，顯微鏡觀察菌絲生長狀態。

1.2.3 SGT1基因參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應分析 （1）葉片細胞死亡觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于Trypan blue染色液（乙醇20 mL，苯酚10 mL，H2O 10 mL，乳酸溶液10 mL，Trypan blue 10 mg）中，染色100℃ 2 min后倒掉染料，加入脫色液（水合三氯乙醛12.5 g，H2O 10 mL）脫色過夜。顯微鏡下觀察細胞死亡狀態［16］。

（2）活性氧產生觀察：接種橡膠樹白粉菌10 d后，剪取葉片置于DAB染液（1 mg/mL二氨基聯苯胺，pH 3.8）染色12 h，清水洗去多余染料，置于95%乙醇脫色過夜。顯微鏡下觀察活性氧產生情況［17］。

（3）擬南芥RNA提取和PR1基因表達檢測：剪取葉片置于預冷的研缽中，加入液氮，反復研磨3次。加入1 mL Invitrogen Trizol溶液，隨后加入200 μL三氯甲烷抽提蛋白。經異丙醇沉淀后，加入DEPC H2O 50 μL。DNA酶37℃消化1 h，氯仿抽提，無水乙醇沉淀，DEPC H2O溶解備用。利用Invitrogen RNA反轉錄試劑盒II進行反轉錄。Real-time PCR反應體系：

SYBR?Premix Ex TaqⅡ 10 μL，20 μmol/L PCR Forward Primer 0.2 μL，20 μmol/L PCR Reverse Primer 0.2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板5 μL，ddH2O 4.2 μL。反應程序：預變性 95℃ 30 s；變性95℃5 s、退火延伸62℃ 40 s，40個循環［18］。

2 結果與分析

2.1 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性分析

圖1 擬南芥對橡膠樹白粉菌的細胞進入抗性和菌絲生長抗性部分依賴于SGT1基因

為了檢測SGT1基因是否參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性，分析了橡膠樹白粉菌在擬南芥上的細胞進入率與菌絲生長長度。接種1 d后，結果表明，sgt1b突變體的白粉菌細胞進入率顯著高于野生型Col-0（圖1A），但低于eds1突變體白粉菌細胞進入率。接種2 d后發現，野生型Col-0菌絲長度為50 μm左右，sgt1b突變體菌絲長度為130 μm左右，是野生型植物的2倍多，差異達極顯著，eds1突變體菌絲長度為230 μm左右（圖1B）。綜上結果表明，SGT1基因參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的早期抗性。

2.2 SGT1基因參與擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性分析

為了檢測SGT1基因是否參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性，我們對葉片發黃表型和菌絲生長狀態進行觀察。對野生型植物Col-0、突變體sgt1b和突變體eds1接種橡膠樹白粉菌10 d后，發現橡膠樹白粉菌在野生型植物上出現明顯的發黃表型，eds1突變體上表現出典型的白粉病病斑，但在sgt1b突變體上幾乎不能看到發黃的表型（圖2A，封三），說明橡膠樹白粉菌在擬南芥突變體sgt1b上不激活發黃的表型。進一步利用考馬斯亮藍染色的方法觀察菌絲的生長狀況。顯微鏡下發現，野生型植物沒有形成菌絲網絡，在擬南芥eds1突變體上形成大量濃密的菌絲網絡，sgt1b突變體表現出稀疏的菌絲網絡（圖2B，封三）。綜上結果表明，SGT1基因參與了擬南芥對橡膠樹白粉菌的后期抗性。

2.3 SGT1基因參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應分析

為了進一步確定SGT1基因是否參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應，我們在擬南芥上檢測了細胞死亡、活性氧產生以及PR1基因表達。接種橡膠樹白粉菌10 d后，通過Trypan blue染色，與野生型植物相比，發現橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激活的細胞死亡明顯減少（圖3A，封三）。通過DAB染色，發現sgt1b和eds1突變體上的活性氧產生與野生型植物相比大大降低（圖3B，封三）。熒光定量PCR反應結果表明，橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激發的PR1基因表達也顯著下降（圖3C，封三）。綜上結果表明，SGT1基因參與橡膠樹

白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應。

3 結論與討論

在植物與病原菌相互作用的過程中，植物利用自身的抗性蛋白可以識別病原菌從而激活抗病反應，以達到抵御病原菌的侵染。在植物抗性蛋白介導的信號通路中，SGT1、RAR1與HSP90三者相互作用，在穩定抗性蛋白方面發揮重要作用［8］。但SGT1與RAR1在不同的抗性蛋白介導的抗病反應中，發揮的功能可能并不相同。例如，馬鈴薯晚疫病的抗性基因RB只需要SGT1，但不需要RAR1。因此，SGT1是否像RAR1參與橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性，目前仍然未知［19］。本研究結果表明，橡膠樹白粉菌在sgt1b突變體上激發的早期抗病性、后期抗病性以及各種抗病反應部分降低，說明SGT1在穩定識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白上也發揮著重要功能。然而，識別橡膠樹白粉菌的TIR-NB-LRR類抗病基因是什么還需要進一步研究鑒定。

值得注意的是，橡膠樹白粉菌并不能在sgt1b上形成分生孢子，意味著橡膠樹白粉菌不能在sgt1b上完成生活世代，這可能是由于識別橡膠樹白粉菌的抗性蛋白不只1個，而是多個抗性蛋白共同發揮作用，但SGT1可能只對其中的某個（些）蛋白的穩定性發揮功能。

［1］ 李響，戴懿，梁鵬，等. 橡膠樹白粉菌誘導寄主及非寄主植物產生活性氧積累的研究［J］. 廣東農業科學，2013（9）：68-71.

［2］ 萬三蓮，梁鵬，宋風雅，等. 橡膠樹白粉菌收集及DNA和RNA提取方法比較［J］. 廣東農業科學，2013（11）：134-139.

［3］ Mei S，Hou S，Cui H，et al. Characterization of the interaction between Oidium heveae and Arabidopsis thaliana［J］. Molecular plant pathology，2016，DOI：10.1111/mpp.12363.

［4］ Kitagawa K，Skowyra D，Elledge S，et al. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex［J］. Mol cell，1999（4）：21-23.

［5］ Azevedo C，Sadanandom A，Kitagawa K，et al. The RAR1 interactor SGT1，an essential component of R gene-triggered disease resistance［J］. Science，2002，295：2073-2076.

［6］ Tor M，Gordon P，Cuzick A，et al. A rabidopsis SGT1b is required for defense signaling conferred by several downy mildew resistance genes［J］. Plant Cell，2002，14：993-1003.

［7］ Peart J R，Lu R，Sadanandom A，et al. Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：10865-10869.

［8］ Hubert D A，Tornero P，Belkhadir Y，et al. HSP90 associates with and modulates the Arabidopsis RPM1 disease resistance protein［J］. EMBO J ，2003，22：5679-5689.

［9］ Muskett P，Parker J. Role of SGT1 in the regulation of plant R gene signaling［J］. Microbes Infect，2003（5）：969-976.

［10］ Holt B F，Belkhadir Y，Dangl J L. Antagonistic control of disease resistance protein stability in the plant immune system. Science，2005，309：929-932.

［11］ Azevedo C，Betsuyaku S. Role of SGT1 in resistance protein accumulation in plant immunity［J］. EMBO J，2006，25：2007-2016.

［12］ Muskett P R，Kahn K，AustinM J，et al . Arabidopsis RAR1 exerts rate limiting control of R gene mediated defenses against multiple pathogens［J］. Plant Cell，2002，14：979-992.

［13］ Tornero P，Merritt P，Sadanandom A，et al. RAR1 and NDR1 contribute quantitatively to disease resistance in Arabidopsis，and their relative contributions are dependent on the R gene assayed［J］. Plant Cell，2002，15：1005-1015.

［14］ Aarts N，Metz M，Holub E，et al. Different requirements for EDS1 and NDR1 by disease resistance genes define at least two R gene-

mediated signaling pathways in Arabidopsis［J］. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95：10306–10311.

［15］ Rong W，Feng F，Zhou J，et al. Effector-triggered innate immunity contributes Arabidopsis resistance to Xanthomonas campestris［J］. Molecular plant pathology，2010，11：783-793.

［16］ Frye C A，Innes R W. An Arabidopsis mutant with enhanced resistance to powdery mildew［J］. Plant Cell，1998，10：947–956.

［17］ Xiao S，Brown S，Patrick E，et al. Enhanced transcription of the Arabidopsis disease resistance genes RPW8.1 and RPW8.2 via a salicylic aciddependent amplification circuit is required for hypersensitive cell death［J］. Plant Cell，2003，15：33–45.

［18］ Lipka V，Dittgen J，Bednarek P，et al. Pre- and postinvasion defenses both contribute to nonhost resistance in Arabidopsis［J］. Science，2005，310：1180–1183.

［19］ Bhaskar P，Raasch J，Kramer C，et al. Sgt1，but not Rar1，is essential for the RB-mediated broad-spectrum resistance to potato late blight［J］. BMC Plant Biology，2008，8：1-9.

（責任編輯 崔建勛）

Positive regulation effect of SGT1 on disease resistance triggered by Oidium heveae in Arabidopsis

RONG Wei1，MEI Shuang-shuang2
（1.College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Oidium heveae is an obligate biotrophic pathogen which infects Hevea brasiliensis and causes powdery mildew disease of rubber trees. It has been reported that O. heveae HN1106 triggers the hypersensitive response in a manner that depends on the effector-triggered immunity proteins EDS1，PAD4，and RAR1 in the model plant Arabidopsis thaliana. As co-chaperones of HSP90，Arabidopsis RAR1 and SGT1 are required to stabilize some R proteins. However，it is still unknown whether SGT1 is involved in O. heveae triggered disease resistance in Arabidopsis. In this study，WT Col-0，sgt1b and eds1 mutants were inoculated with O. heveae HN1106，and the phenotypes of O. heveae cell entry ratio，plant disease symptoms，cell death，ROS production and O. heveae HN1106 hyphal growth were analyzed. These results indicated that SGT1 was required for O. heveae HN1106-triggered early stage and late stage disease resistance and defense responses.

Oidium heveae；Arabidopsis；SGT1；disease resistance

Q945.8

A

1004-874X（2016）10-0112-05

2016-07-12

國家自然科學基金（31560296）

戎偉（1978-），男，博士，講師，E-mail：rongwei13@126.com

梅雙雙（1975-），女，博士，講師，E-mail：mssrw2002@126.com

戎偉， 梅雙雙. SGT1正調控橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病性［J］.廣東農業科學，2016，43（10）：112-116.

橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）是一種專性活體寄生真菌，主要侵染橡膠樹的嫩葉、嫩芽和花序，使橡膠樹產生白粉病，對天然橡膠的產量造成極大影響［1-2］。目前學者對橡膠樹和橡膠樹白粉菌二者的遺傳背景不甚了解，難以進行遺傳操作，對兩者的互作機制了解非常少。最新研究發現，橡膠樹白粉菌在模式植物擬南芥上激活抗病反應，該抗病反應依賴于EDS1 （Enhanced Disease Susceptibility 1）、PAD4（Phytoalexin Deficient 4） 和RAR1 （Required for Mla12 Resistance） ，表明擬南芥Toll-Interleukin1 Receptor （TIR）-nucleotide binding （NB）-

leucine-rich repeat （LRR） 類抗病基因參與了橡膠樹白粉菌激活的抗病性［3］。 擬南芥遺傳背景清晰，因此，橡膠樹白粉菌與擬南芥的相互作用為將來研究橡膠樹白粉菌的致病機理提供了很好的模型。