82種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性研究

梁志凌，馬艷平，馬江耀，郝 樂，劉振興，柯 浩

（ 廣東省農科院動物衛生研究所/ 廣東省獸醫公共衛生公共實驗室/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

82種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性研究

梁志凌，馬艷平，馬江耀，郝 樂，劉振興，柯 浩

（ 廣東省農科院動物衛生研究所/ 廣東省獸醫公共衛生公共實驗室/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

采用瓊脂擴散法的牛津杯法，測定82種中草藥水提物對羅非魚（Tilapia sp.）無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的體外抑菌活性，并采用紙片法選擇幾種活性較強的中草藥水提物對無乳鏈球菌進行聯合藥敏試驗。結果顯示，黃連、五倍子、紅藤、大蒜、北五味子、夏枯草、艾葉、蘇木、三棵針、紫蘇、土槿皮、老鶴草、石榴皮、大黃、丹參、魚腥草、虎杖、赤芍、車前草、田基黃20種中草藥水提物對無乳鏈球菌表現出明顯的體外抑菌活性，其中黃連、五倍子的體外抑菌效果最顯著；中草藥聯合藥敏試驗結果表明，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、虎杖、黃連表現為協同作用；黃連與大黃、丹參、蘇木、紅藤表現為協同作用，與艾葉、北五味子、石榴皮表現為拮抗作用；三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子表現為協同作用，與艾葉、北五味子、虎杖表現為拮抗作用。

中草藥；羅非魚；無乳鏈球菌；聯合藥敏試驗；抑菌活性

羅非魚是聯合國糧農組織推薦的養殖品種，被世界各地廣泛引種與養殖［1］。我國的環境和氣候條件適合羅非魚生產，這些有利條件使我國成為羅非魚養殖的主要國家之一［2］，羅非魚養殖已成為我國南方地區的支柱性產業［3］，我國也成為世界上最大的羅非魚生產國和出口國。近年來隨著羅非魚的養殖密度增大、養殖環境惡化，病害頻發成為制約我國羅非魚產業發展的主要因素，其中無乳鏈球菌引起的細菌性疾病近年有加劇趨勢，已成為羅非魚的重要病原，對羅非魚養殖造成重大損失［3］。鏈球菌可利用宿主巨噬細胞逃避抗生素類藥物對其殺害［4］，長期使用抗生素藥物導致現有羅非魚源病原菌分離株對許多允許使用的抗生素耐藥性增強，導致利用抗生素防治鏈球菌病的效果不太理想，造成羅非魚細菌病的治療困難，此外考慮到食品安全及環境保護問題，臨床上迫切需要尋找綠色安全有效的抗生素替代品以減少抗生素使用，最終實現有效防治羅非魚細菌病的目標。中草藥是純天然的藥物，具有多功能多靶點作用、不易引起病菌耐藥性以及無藥物殘留等優點，目前在水產養殖動物病害防控的應用中越來越受到重視。本研究分析了黃連、五倍子、紅藤等82種中草藥水提物對羅非魚無乳鏈球菌的體外抑菌作用，以期為鏈球菌病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃連、五倍子、紅藤等82種中草藥由廣州市萬怡大藥房提供。

無乳鏈球菌為廣東省農科院動物衛生研究所從廣東省廣州市增城市某羅非魚養殖場患病羅非魚中分離、鑒定并保存。

THB培養基：酵母浸出物3 g/L，胰蛋白胨20 g/L，牛肉浸膏5 g/L，葡萄糖2 g/L，Na2CO32.5 g/L，NaCl 2 g/L，Na2HPO40.4 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH7.2～7.4。THB液體培養基：THB培養基不加瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥水提液的制備 稱取中草藥50 g，加純水約500 mL浸泡1 h后置于加熱板上溫火煮沸1 h，12層紗布過濾；如上反復煎煮3次，收集濾液。濾液用濾紙過濾后濃縮成含生藥1 g/mL的提取液，于121℃滅菌 15 min，置于4℃冰箱中保存備用。大蒜提取液制備［5］：取市售大蒜去皮搗碎，加入適量蒸餾水，擠壓過濾，制成含生蒜1 g/mL的大蒜提取液。

1.2.2 病原菌菌懸液的制備 將無乳鏈球菌菌株在THB培養基上劃線培養24 h，用THB液體培養基沖洗，在28℃條件下搖床振蕩培養20 h，稀釋為5×107cfu/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 抑菌活性的測定 采用瓊脂擴散法的牛津杯法［6］，取直徑90 mm，高16～17 mm的玻璃培養皿，注入加熱融化的THB培養基20 mL，使其在碟底均勻攤布，置于水平臺面上使其凝固，制成THB培養基平板備用。吸取0.1 mL菌懸液，置于THB培養基并涂布均勻。在每個平板以等距離均勻放置牛津杯3個。吸取中藥藥液0.3 mL注入牛津杯內，將加滿藥液的平板置于28℃生化培養箱中培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小，每種藥液在不同平板上重復3次，取其平均值；另以無菌水作為空白對照。以抑菌圈直徑表示抑菌活性，抑菌圈直徑≥15 mm表示抑菌活性較強，＜15 mm表示抑菌活性較弱。

1.2.4 中草藥水提物聯合藥敏試驗［7］于培養皿內加入預熱融化的THB培養基，均勻攤布，置于水平臺面上使其凝固，制成THB培養基平板備用。吸取0.1 mL菌懸液，置于THB平板培養基并涂布均勻。將兩種含中藥紙片貼于平板上，兩片之間相距以2～3 mm為宜，置于28℃孵育過夜，取出觀察結果。根據呈現的抑菌圖形，結果判定“協同”、“相加”、“無關”或者“拮抗”作用。本次分別以五倍子、黃連、三棵針為主藥，測定主藥與其他中藥對無乳鏈球菌的聯合藥敏。

2 結果與分析

2.1 中草藥水提物的體外抑菌活性

82種中草藥水提物對無乳鏈球菌的體外抑菌活性測定結果見表1。從表1可見，黃連、五倍子、大蒜、北五味子、夏枯草、艾葉、蘇木、三棵針、紫蘇、土槿皮、石榴皮、老鶴草、魚腥草、虎杖、赤芍和車前草等16種中草藥水提物對無乳鏈球菌的抑菌圈達到15 mm以上，有較強的體外抑菌活性，其抑菌活性由強至弱順序為黃連＞五倍子＞大蒜＞北五味子＞夏枯草、艾葉＞蘇木＞三棵針、紫蘇、土槿皮＞石榴皮、老鶴草＞魚腥草＞虎杖、赤芍、車前草，其中黃連、五倍子的體外抑菌效果尤為顯著，抑菌圈達到35 mm以上；田基黃、香薷、桑寄生、馬齒莧、厚樸、山豆根和敗醬草等7種中草藥水提物對無乳鏈球菌產生抑菌圈，但抑菌圈直徑小于15 mm，呈微弱的抑菌活性；其余中草藥水提物對無乳鏈球菌沒有呈現抑菌圈，無抑菌活性。

2.2 中草藥水提物聯合藥敏試驗結果

采用瓊脂擴散紙片法選擇幾種活性較強的中草藥水提物對無乳鏈球菌進行聯合藥敏試驗。根據呈現的抑菌圖形，瓊脂擴散紙片法一般出現協同作用、相加作用、無關作用和拮抗作用4種結果。協同作用有3種情況：（1）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩者又能聯合增效，抑菌圈交界角平直；（2）甲藥無抑菌活性，乙藥的抑菌圈向甲藥擴大；（3）甲、乙兩藥均無抑菌活性，但兩藥之間出現抑菌區域。本試驗為第1種情況。相加作用甲、乙兩藥的抑菌圈相連，交界角呈現鈍圓形。無關作用也有3種情況：（1）甲、乙兩藥均無抑菌活性，無抑菌圈；（2）甲藥無抑菌活性，乙藥有抑菌活性，圖形表現為甲藥無抑菌圈，乙藥呈現完整抑菌圈；（3）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩藥抑菌圈交角處呈尖銳形狀。本試驗為第3種情況。拮抗作用有2種情況：（1）甲藥無抑菌活性，乙藥有抑菌活性，甲藥對乙藥抑菌圈呈切割形狀；（2）甲、乙兩藥均有抑菌活性，兩藥抑菌圈向相反方向偏移。本試驗為第2種情況。

試驗結果（表2）顯示，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、黃連、虎杖表現為協同作用；黃連與大黃、紅藤、蘇木、丹參表現為協同作用，與石榴皮、艾葉、北五味子表現為拮抗作用；三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子表現為協同作用，與艾葉、北五味子、虎杖表現為拮抗作用。

3 結論與討論

由于中藥藥液的抑菌活性較弱，紙片吸載的中藥量過少，抑菌圈往往太小，難以達到測量要求，因此一般較少采用紙片法。本試驗選用牛津杯瓊脂擴散法進行試驗，牛津杯內加滿藥液可以保證充分滲透，試驗結果抑菌圈相對大些。此外，某些中草藥水提液含有膠質，造成不同的藥液粘度不同，導致加入牛津杯里的藥液在瓊脂培養基上的擴散速度有差異，在一定程度上影響抑菌圈的大小。本試驗供試藥液均采用中藥傳統的煎煮法提取，這一方法適用于有效成分能溶于水，且對濕、熱均穩定的藥材。這一方法提取的成分比較復雜，除有效成分外，提取液往往含雜質較多，且有少量脂溶性物質溶出；另外某些不溶于水的成分含量低，高溫煎煮也致使揮發性物質丟失，因此可能導致藥液中有效成分損失較多、有效成分提取不完全等問題［8］，對中藥的抑菌試驗結果有一定影響。

本研究對82種中草藥的抗無乳鏈球菌活性進行篩選，結果發現部分中草藥對羅非魚無乳鏈球菌具有明顯的體外抑制活性，其中黃連、五倍子表現出很強的抑制活性。黃連的抗菌成分主要是黃連堿，五倍子含有大量鞣質，可以與生物體的蛋白質、核酸、多糖及生物堿結合產生沉淀作用，影響細菌的營養和代謝，從而表現出顯著的抗菌作用［9］。大蒜中的大蒜素能與巰基酶競爭性結合，抑制菌體代謝酶的活性，通過脂質過氧化等作用損傷菌體的膜系統，影響菌體生長的大環境［10］。北五味子的主要有效成分為木脂素類化合物，具有抗菌、抗氧化等功效［11］。夏枯草水提物含有豐富的三萜類、甾體類、黃酮類等化學成分，有一定的抑菌作用［12］。三棵針主要通過喹啉類生物堿如黃連素發揮抗菌作用［13］。石榴皮含有石榴皮多酚，是發揮抗菌作用的主要成分［14］。魚腥草多種成分亦具有抗菌作用，本研究結果與文獻相符［15］。其他中草藥的有效成分和作用機制有待進一步探討。

表1 82種中草藥水提物對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性

（續表1）

表2 中草藥水提物對羅非魚無乳鏈球菌的聯合藥敏試驗結果

考慮到組方的需要，本研究選取五倍子、黃連、三棵針、大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、虎杖和夏枯草等12種中草藥進行聯合藥敏試驗，結果表明，五倍子與大黃、艾葉、丹參、蘇木、北五味子、紅藤、石榴皮、黃連、虎杖均表現為協同作用。三棵針與大黃、丹參、蘇木、紅藤、石榴皮、黃連、夏枯草、五倍子也表現為協同作用，作為復方中藥制劑組方的基礎，這為漁藥開發綠色安全有效抗生素替代品提供了一定的參考。

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（責任編輯 崔建勛）

Antimicrobial activities of 82 kinds of Chinese herbal medicines against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro

LIANG Zhi-ling，MA Yan-ping，MA Jiang-yao，HAO Le，LIU Zhen-xing，KE hao
（ Animal Health Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Guangzhou 510640，China）

The antimicrobial activities of 82 Chinese herb aqueous extracts against the pathogen of Streptococcus from tilapia in vitro were screened by the agar Oxford plate diffusion system. Results demonstrated that 20 kinds of Chinese herbs could effectively inhibit the growth of S. agalactiae，Coptis chinensis and Galla chinensis had the best inhibitory effects. In the combined susceptibility test，disc agar diffusion was used to evaluate the combination effects of 12 Chinese herb aqueous extracts in vitro against the pathogen of Streptococcus from tilapia. The results showed that there was synergic effect for the combined inhibition of aqueous extracts from Galla chinensis and Rheum palmatum L. or Artemisia argyi Levl. et Vant. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Schisandra chinensis or Sargentodoxa cuneata or Punica granatum L. or Reynoutria japonica Houtt or Coptis chinensis ；synergic effect for Coptis chinensis and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata；synergic effect for Berberis spp. and Rheum palmatum L. or Salvia miltiorrhiza or Caesalpinia sappan or Sargentodoxa cuneata or Punica

Chinese herbal medicine；Tilapia sp.；Streptococcus agalactiae；combined susceptibility test；antimicrobial activities

S948

A

1004-874X（2016）10-0128-06

2016-06-20

廣東省魚病防治專項（2014010701）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201601B04）

梁志凌（1970-），女，獸醫師，E-mail：snailt@126.com

柯浩（1965-），男，碩士，研究員，E-mail：keha@tom.com

梁志凌 ，馬艷平，馬江耀，等. 82種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性研究［J］.廣東農業科學，2016，43（10）：128-133.

granatum L. or Coptis chinensis or Prunella vulgaris Linn or Schisandra chinensis. But the effect of combination of aqueous extracts was inhibitory interaction between Coptis chinensis and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Punica granatum L.，inhibitory interaction between Berberis spp. and Artemisia argyi Levl. et Vant. or Schisandra chinensis or Reynoutria japonica Houtt. Combination of Galla chinensis and Prunella vulgaris Linn or Berberis spp.，Coptis chinensis and Reynoutria japonica Houtt or Prunella vulgaris Linn or Galla chinensis or Berberis spp. showed indifferent interactions.