采用Biolog法分析餐廚垃圾厭氧消化微生物群落多樣性

梅 冰, 彭緒亞， 謝 影

(1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)節(jié)能減排檢測工程中心， 昆明 650000；2.重慶大學(xué)， 重慶 400045)

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采用Biolog法分析餐廚垃圾厭氧消化微生物群落多樣性

梅 冰1, 彭緒亞2， 謝 影2

(1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)節(jié)能減排檢測工程中心， 昆明 650000；2.重慶大學(xué)， 重慶 400045)

該研究在中溫條件下進行實驗室規(guī)模的連續(xù)式餐廚垃圾厭氧消化試驗，用Biolog方法分析了反應(yīng)器各個運行階段污泥中微生物群落的多樣性。多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明：反應(yīng)器中各個階段微生物物種豐富度和常見的物種接近，但均一性各階段有較大的差異。ECO板上碳源的利用情況不同，表明反應(yīng)器各個階段微生物群落呈現(xiàn)出不同的微生物多樣性。主成分分析結(jié)果顯示，反應(yīng)器在啟動與穩(wěn)定運行階段微生物種群多樣性較為接近，而與反應(yīng)器抑制階段和恢復(fù)階段微生物種群多樣性差異性明顯。

餐廚垃圾；微生物多樣性；Biolog法；主成分分析；厭氧消化

長期以來由于技術(shù)和管理手段的缺乏，我國餐廚垃圾未能得到有效處理，引發(fā)了一系列社會民生問題，同時也造成大量生物質(zhì)資源的浪費。為避免餐廚垃圾帶來的公共衛(wèi)生安全隱患，利用厭氧消化處理餐廚垃圾，并回收其中蘊含的豐富資源，已成為餐廚垃圾資源化的重要途徑[1]。厭氧消化是一個復(fù)雜的過程包括一系列的微生物將有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷。降解過程非常復(fù)雜，依賴于多種微生物維持系統(tǒng)平衡。餐廚垃圾厭氧消化處理過程中，厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)的微生物種群對有機成份的高效轉(zhuǎn)化、反應(yīng)器的穩(wěn)定運行都有極為重要的影響。因此，對餐廚垃圾厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)微生物群落多樣性進行研究，對于指導(dǎo)餐廚垃圾厭氧消化反應(yīng)器的穩(wěn)定運行具有十分重要的理論意義與工程應(yīng)用價值。

Biolog最初被用于純種微生物鑒定, 1991年Garland和Mills首次將該方法應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究[2]。將Biolog用于微生物群落的研究具有很多優(yōu)點[3]。Biolog微平板技術(shù)因其操作標(biāo)準化分辨力強無需純培養(yǎng)測定簡便等優(yōu)點，已成為一種簡單快速的表征微生物特性的方法，并廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物群落的研究中[4]。楊永華[5]等對農(nóng)藥污染過的土壤中的微生物群落進行了用Biolog方法測定。研究結(jié)果顯示，農(nóng)藥污染土壤導(dǎo)致了土壤中的微生物種類的減少，同時土壤中的微生物代謝功能多樣性也出現(xiàn)了明顯的下降。2002年南非的Jvan Heerden[6]等人對5個城市的污水處理廠活性污泥利用Biolog GN和GP板做了不同稀釋倍數(shù)下微生物多樣性的研究，發(fā)現(xiàn)Biolog系統(tǒng)能夠用于測定微生物群落的功能多樣性和均一性。雖然在表征微生物群落時存在一定的限制，但這種快速的技術(shù)仍然是一種區(qū)別微生物群落的有效工具。微平板技術(shù)主要應(yīng)用于對土壤方面的微生物多樣性以及活性污泥中的微生物多樣性進行分析，而使用Biolog技術(shù)對厭氧反應(yīng)器在失衡條件下的微生物群落多樣性的研究論文還沒有相關(guān)的報道。本研究在中溫條件下進行實驗室規(guī)模的連續(xù)式單相厭氧消化試驗, 采用Biolog技術(shù)研究厭氧消化反應(yīng)器從穩(wěn)定運行到反應(yīng)器出現(xiàn)抑制直至反應(yīng)器恢復(fù)的各個階段，深入研究微生物種群多樣性的變化，以期為餐廚垃圾厭氧消化機理研究及厭氧消化反應(yīng)器的穩(wěn)定運行提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 厭氧消化系統(tǒng)

實驗研究是在一個實驗室規(guī)模的CSTR (continuously stirred tank reactor )反應(yīng)器中進行的，該裝置沒有沼氣循環(huán)系統(tǒng)。反應(yīng)器是用PVC材料制作的，有效容積為20 L。消化器內(nèi)部安裝了一個溫度感應(yīng)器。溫度被維特在37℃±1℃，通過一個加熱夾套與水箱相連接。攪拌電機的攪拌速度被設(shè)定為每分鐘40轉(zhuǎn)。

1.2 餐廚垃圾

餐廚垃圾來自重慶大學(xué)的學(xué)生餐館。餐廚垃圾通過自動破碎機破碎成平均大小為5.0 mm的碎片。試驗樣品主要性質(zhì)指標(biāo)測試結(jié)果固體含量(TS)為24.93%，揮發(fā)性固體含量(VS)為20.71%，粗脂肪為6.02%。

1.3 反應(yīng)器污泥

反應(yīng)器使用的活性污泥是厭氧消化反應(yīng)器成功啟動穩(wěn)定運行的污泥[14]。

1.4 反應(yīng)器運行方式

反應(yīng)器在容積負荷(OLR)為1.0 kgVS·m-3d-1下運行了2個月。容積負荷突然從1.0 kgVS·m-3d-1增加到4.0 kgVS·m-3d-1，這一天被報道為實驗的第0 d。反應(yīng)器在4.0 kgVS·m-3d-1的容積負荷下運行了4 d。

在反應(yīng)器運行在5～26 d的過程中，OLR逐漸從5.0 kgVS·m-3d-1增加到7.5 kgVS·m-3d-1。實驗過程中，反應(yīng)器運行到OLR分別在第5，8，15，21 d，逐漸增加到5.0，6.0，7.0 和 7.5 kgVS·m-3d-1。當(dāng)OLR增加到7.5 kgVS·m-3d-1的時候，厭氧消化器產(chǎn)生了一個強烈的抑制。因此，決定減少進料一段時間。因而，反應(yīng)器在第27～37 d在1.0 kgVS·m-3d-1負荷下運行,在38～45 d在4.0 kgVS·m-3d-1負荷下運行。

1.5 試驗物料

試驗所用樣品為厭氧消化反應(yīng)器所產(chǎn)生的厭氧消化污泥，分別以第一次沖擊負荷試驗過程中啟動期、穩(wěn)定期、失衡期以及恢復(fù)穩(wěn)定期共四個具有代表性時期的沼渣作為試驗樣品，具體描述如下表1。將試驗樣品用15 mL離心管保存于4℃冰箱中，一周內(nèi)進行Biolog試驗。

表1 試驗樣品 (kgVS·m-3d-1)

1.6 監(jiān)測參數(shù)與分析方法

試驗主要監(jiān)測指標(biāo)包括反應(yīng)器內(nèi)料液的pH值，氣體組分，MLSS，MLVSS等指標(biāo)。所有的這些指標(biāo)，采取APHA的標(biāo)準方法進行測定[7]。厭氧消化所產(chǎn)生的氣體由濕式氣體流量計測定記錄。氣體成分及其含量采用氣相色譜儀(GC)測定[8]。Biolog-ECO板接種液制備及數(shù)據(jù)讀取接種液的制備參考文獻[9]的方法，本研究中，取樣品稀釋液分別接種于Biolog-ECO 微平板，每孔100 ul將接種于微平板，微平板在28℃下培養(yǎng)，分別于24，28，72，96，120，144，168，192，216和240 h在590 nm和750 nm下測定吸光度值，微生物代謝強度采用平均吸光度(AWCD)來描述[10,15]。

計算公式為:

AWCD=[∑(C-R)]/31

式中，C為反應(yīng)孔的590 nm吸光度值；R為對照孔750 nm的吸光度值。

對各生物相的平均吸光度值隨時間的變化曲線進行分析后采用培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)計算微生物群落的多樣性指數(shù)[13-15]，并應(yīng)用SPSS18.0軟件進行主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗過程中容積產(chǎn)氣率和容積負荷的變化

試驗過程中容積產(chǎn)氣率和容積負荷的變化見圖1，反應(yīng)器在容積負荷為1.0 kgVS·m-3d-1下，大約運行了2個月的時間。容積負荷突然從1.0 kgVS·m-3d-1增加到4.0 kgVS·m-3d-1，在4.0 kgVS·m-3d-1下運行了4 d。在5～21 d，容積產(chǎn)氣率隨容積負荷的增加而逐漸增加，反應(yīng)器運行穩(wěn)定在第22 d，將7.5 kgVS·m-3d-1容積負荷餐廚垃圾加入到厭氧消化器中，容積產(chǎn)氣率從6.42 L·L-1d-1(第22 d)急劇的下降到 3.67 L·L-1d-1(第26 d)。因此可以確定在這個階段厭氧消化反應(yīng)器受到了強烈的抑制。為了讓反應(yīng)器從抑制中恢復(fù)過來，決定減少進料直到厭氧消化器恢復(fù)正常。因而，反應(yīng)器在第27～37 d在1.0 kgVS·m-3d-1下運行，在38～45 d在4.0 kgVS·m-3d-1下運行，容積產(chǎn)氣率隨容積負荷的增加而逐漸增加，反應(yīng)器逐漸從抑制過程中恢復(fù)過來。

圖1 試驗過程中容積產(chǎn)氣率和容積負荷的變化

2.2 微生物群落代謝強度的變化

Biolog生態(tài)微平板可以快速簡單分析微生物群落功能多樣性，AWCD用以衡量微生物利用不同碳源的整體能力，從功能代謝水平上揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，是反映微生物活性、描述微生物群落利用碳源功能多樣性的一個重要指標(biāo)。微生物AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化情況見圖2。由圖2可以看出，AWCD值在48 h時升高幅度提高，72 h進入指數(shù)期，144 h達到穩(wěn)定期。AWCD值變化趨勢不同，表明反應(yīng)器在不同階段碳源利用能力與微生物豐度存在差異。實驗各樣品平均吸光度數(shù)值總體大小為：啟動期>恢復(fù)穩(wěn)定期>抑制期>穩(wěn)定期，說明反應(yīng)器不同時期微生物對碳源的利用能力是存在差異的，抑制期對碳源的利用能力總體上要高于穩(wěn)定期。AWCD值變化趨勢不同，表明反應(yīng)器在抑制期與穩(wěn)定期中的微生物豐度存在一定差異。

圖2 平均吸光度隨時間的變化

2.3 微生物群落功能多樣性分析

采用生態(tài)學(xué)中的3種多樣性指數(shù)來分析反應(yīng)器中微生物群落功能的多樣性,結(jié)果如表2所示。所采用的3種多樣性指數(shù)反映了微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面, 其中Shannon指數(shù)受群落物種豐富度影響較大, Simpson指數(shù)反映了群落中最常見的物種，而McIntosh指數(shù)則是度量群落物種均一性的指標(biāo)。反應(yīng)器運行在穩(wěn)定階段同抑制階段相比較，Shannon指數(shù)差異性較小。Simpson指數(shù)與McIntosh指數(shù)差異性較大。Simpson指數(shù)從穩(wěn)定期的3.77下降到抑制期的3.25。McIntosh指數(shù)從穩(wěn)定期的14.42上升到15.14。說明反應(yīng)器從穩(wěn)定階段運行到抑制階段過程中，反應(yīng)器中微生物群落最為常見的物種與群落物種豐富度有較為明顯的差異。

表2 微生物功能多樣性

S R Caroline[11]等研究了8個序批式反應(yīng)器組成的活塞流式厭氧反應(yīng)器在25℃處理豬糞時細菌群落的變化，結(jié)果表明反應(yīng)器在穩(wěn)定階段與抑制階段，細菌的多樣性有明顯的差異，這與此次實驗的研究結(jié)果一致。此次實驗通過Biolog微平板技術(shù)對厭氧消化反應(yīng)器從穩(wěn)定運行到反應(yīng)器出現(xiàn)抑制的兩個階段進行了深入的研究。通過微生物群落多樣性指數(shù)對反應(yīng)器運行在穩(wěn)定階段和抑制階段進行比較分析，Shannon指數(shù)差異性較小，Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)差異性較大。Simpson指數(shù)從穩(wěn)定期的3.77下降到抑制期的3.25。McIntosh指數(shù)從穩(wěn)定期的14.42上升到15.14。可見，反應(yīng)器從穩(wěn)定階段到抑制階段群落中最為常見的物種與群落物種豐富度有較為明顯的差異，這個研究結(jié)論 與S R Caroline[11]等人的研究結(jié)論基本一致，并且有具體的群落多樣性指數(shù)數(shù)值，可以更加形象具體的描述微生物群落多樣性，相比S R Caroline等人的研究成果更加詳細、具體。

2.4 微生物不同種類碳源利用與微生物種群多樣性的主成分分析

采用培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)對ECO板上碳源的利用情況進行分析, 試驗顯示第4 d的樣品對L-天冬酰胺酸,丙酮酸甲脂,4-羥基苯甲酸，L-絲氨酸，吐溫80，葡萄糖-1-磷酸鹽，甘氨酰-L-谷氨酸利用較快且充分；第15 d的樣品對葡萄糖-1-磷酸鹽，D-纖維二糖，甘氨酰-L-谷氨酸，L-a-甘油，D-葡萄胺酸，L-精氨酸較容易利用；第26 d的樣品對D-葡萄胺酸，4-羥基苯甲酸、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、衣康酸、葡萄糖-1-磷酸鹽利用較完全；第35 d的樣品利用吐溫80，4-羥基苯甲酸，吐溫40，腐胺，β-甲基D-葡萄糖苷，D-半乳糖內(nèi)酯較充分。反應(yīng)器各個階段的微生物對ECO板上碳源的利用情況不同，說明反應(yīng)器在各個階段的活性污泥呈現(xiàn)出不同的微生物多樣性。

C Delbes[12]等人采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測分析16SrRNA的擴增產(chǎn)物，分別研究了乙酸累積導(dǎo)致系統(tǒng)失衡前后細菌菌群的變化，其結(jié)果表明一種螺旋菌(Clostridium.spp)和聯(lián)合菌屬(Synergiste.spp)菌群表現(xiàn)出較高活性， Clostridium sp的數(shù)量在反應(yīng)器失衡后明顯增加。C Delbes等人通過PCR-SSCP技術(shù)，認為反應(yīng)器在失衡前后細菌菌群多樣性出現(xiàn)了明顯的變化。在厭氧反應(yīng)器中的微生物種類非常多，C Delbes[12]等人通過PCR-SSCP技術(shù)，在反應(yīng)期失衡前后分離出Clostridium.sp和Synergistes.spp，認為兩種細菌在反應(yīng)器失衡之后數(shù)量明顯增加。這個研究結(jié)果有較大的局限性，畢竟在反應(yīng)器失衡前后絕大部分微生物是不能夠鑒定出來的，鑒定出來的這2種細菌并沒有太大的代表性。在本研究過程中，通過Biolog技術(shù)可以直接對反應(yīng)器抑制前后，厭氧消化反應(yīng)器從穩(wěn)定運行到反應(yīng)器出現(xiàn)抑制的2個階段進行深入研究，通過對微生物不同種類碳源利用進行比較分析。通過數(shù)據(jù)對比可以發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期系統(tǒng)中微生物對碳源利用能力碳水化合物和氨基酸類碳源利用能力較強，而其它碳源相對利用較少，微生物對碳源利用能力最強的10種碳源中6種屬于碳水化合物，4種屬于氨基酸類；而抑制期對碳水化合物、氨基酸類、羧酸類和多聚物類多種碳源均表現(xiàn)出較高的利用能力，微生物對碳源利用能力最強的10種碳源中，3種屬于碳水化合物，3種屬于氨基酸類，2種屬于羧酸類，2種屬于多聚物類。說明厭氧消化系統(tǒng)在抑制期內(nèi)吸收碳水化合物和氨基酸類的微生物豐度有明顯降低，吸收羧酸類和多聚物類的微生物豐度有明顯增高。

采用培養(yǎng)72 h的微生物碳源利用率的數(shù)據(jù)，使用SPASS軟件做出反應(yīng)器中微生物種群多樣性的主成分分析圖。各樣本在空間上位置的不同是和微生物利用碳底物的利用能力相關(guān)聯(lián)的。具體而言，各樣本在PC空間不同PC軸坐標(biāo)的差異是與對聚集在該PC軸上碳源的利用能力相聯(lián)系的，主成分分析可以將不同樣本的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量，在降維后的主元向量空間中用點的位置直觀地反映出來。通過對31種單一碳源的主成分分析可知，決定主成分1(CP1)的碳源為L-絲氨酸，D-葡萄胺酸，甘氨酰-L-谷氨酸等12種碳源；決定主成分2(CP2)的碳源為a-丁酮酸，衣康酸，I-赤藻糖醇等8種碳源。如圖3所示。第1主成分特征值的貢獻率為54.92%，遠大于第2主成分特征值的貢獻率24.32%。因而能很好地區(qū)分各反應(yīng)器各階段微生物的多樣性。從圖中還可以看出，第4 d與第15 d主成分分析差異性較小，而與反應(yīng)器其它運行階段主成分差異性明顯，表明反應(yīng)器在啟動與穩(wěn)定運行階段微生物種群多樣性較為接近，而與反應(yīng)器抑制階段和恢復(fù)階段微生物種群多樣性差異明顯。從圖中還可以看出，第15 d的樣品與第26 d的樣品主成分差異性明顯，表明反應(yīng)器在穩(wěn)定運行階段和抑制階段，微生物種群多樣性出現(xiàn)了明顯差異。從圖中也可以看出，第26 d的樣品與第35 d的樣品主成分差異性明顯，表明反應(yīng)器在抑制階段與恢復(fù)性階段，微生物種群多樣性差異明顯。

圖3 72小時的主成分因子荷載圖

國內(nèi)外關(guān)于對厭氧反應(yīng)器在失衡條件下的微生物群落多樣性的研究論文較少。目前從已經(jīng)報道的研究資料來看，使用分子生物學(xué)16SRNA的技術(shù)比較多，而使用Biolog的技術(shù)還沒有相關(guān)的報道。采用分子生物學(xué)16SRNA技術(shù)是對樣品中優(yōu)勢微生物DNA進行分析，而采用Biolog微平板技術(shù)是通過樣品對不同碳源的吸收能力進行數(shù)據(jù)采集，然后依靠計算公式和分析軟件進行相關(guān)分析。由于同種微生物(16SRNA相同)在不同的生態(tài)環(huán)境中，代謝途徑有可能有較大的差異。因此，使用Biolog微平板技術(shù)對微生物群落多樣性進行研究具有誤差小，精度高等優(yōu)勢。

國內(nèi)學(xué)者采用PCR-TGGE技術(shù)對餐廚垃圾單相厭氧反應(yīng)器中的細菌群落結(jié)構(gòu)分的研究結(jié)果表明，反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)一直處于動態(tài)變化過程中，各階段間微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的階段性演替，本實驗通過72 h的主成分因子荷載圖可以看出，反應(yīng)器從穩(wěn)定運行到反應(yīng)器出現(xiàn)抑制，微生物種群多樣性差異明顯[13]。這個實驗結(jié)論與彭緒亞的前期實驗結(jié)果一致。然而，彭緒亞采用的PCR-TGGE通過16SRNA技術(shù)對樣品中優(yōu)勢的微生物DNA進行分析，只是得到了厭氧反應(yīng)器中穩(wěn)定運行與抑制階段微生物群落結(jié)構(gòu)演替這個結(jié)論，而72 h的主成分因子荷載圖則可以直觀的顯示反應(yīng)器在穩(wěn)定運行階段與抑制階段的微生物多樣性的差異大小，更加形象的描述出微生物群落多樣性的差異。

3 結(jié)論

(1)抑制期與穩(wěn)定期的AWCD值變化趨勢不同，表明反應(yīng)器在抑制期與穩(wěn)定期相比較微生物豐度存在差異；抑制期與穩(wěn)定期吸光度值總體抑制期大于穩(wěn)定期，說明反應(yīng)器在抑制期和穩(wěn)定期對碳源的利用能力是存在差異的，抑制期對碳源的利用能力總體上要高于穩(wěn)定期。

(2)穩(wěn)定期同抑制階段相比較，Simpson指數(shù)與McIntosh指數(shù)差異性較大，Simpson指數(shù)從穩(wěn)定期的3.77下降到抑制期的3.25，McIntosh指數(shù)從穩(wěn)定期的14.42上升到15.14，說明反應(yīng)器從穩(wěn)定階段到抑制階段，微生物群落中最為常見的物種與群落物種的豐富度有較為明顯的差異。

(3) 通過微生生物種群多樣性主成分分析，第15 d的樣品與第26 d的樣品主成分差異性明顯。表明反應(yīng)器在穩(wěn)定運行階段和抑制階段，微生物種群多樣性差異明顯。

(4)通過72 h的主成分因子荷載圖可以形象的看出反應(yīng)器在穩(wěn)定運行階段和抑制階段，微生物種群多樣性出現(xiàn)了明顯差異；抑制階段與恢復(fù)性階段相比，微生物種群多樣性差異明顯。通過對微生物不同種類碳源利用的比較分析，說明當(dāng)厭氧消化系統(tǒng)出現(xiàn)抑制的時候，微生多樣性出現(xiàn)了明顯變化。一方面以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等以吸收碳水化合物和氨基酸類等簡單化合物的微生物的豐度明顯減少；另一方面以吸收羧酸類和多聚物類復(fù)雜化合物的微生物的豐度明顯增高。

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Microbial Diversity Analysis for Anaerobic Digestion of Kitchen Waste by Biolog Method

Mei Bing1, PENG Xu-ya2, XIE Ying2

(1.Yunnan Agricultural University，kunming 650000，China；2.Chongqing University , chongqing 40045，China )

Lab-scale continuous anaerobic digestion of kitchen waste at mesophilic temperature was carried out in this study. Biolog method was used to analyze the microbial diversity of sludge during each stage in the reactor. According to the diversity index analysis, the microbial species of every stage in the reactor had a resemblance in richness to the most common species, but the evenness was quite different. The differences in carbon source utilization on ECO plate indicated the differences in microbial structures, species and quantity in each stage, which presented the diversity of microbial communities. According to the principal component analysis, the microbial communities in the reactor was similar during the starting and stable periods, but the microbial communities were quite different during the inhibition and recovery period.

food waste; microbial diversity; biolog method ;principal component analysis ; anaerobic digestion

2015-03-30

項目來源： 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動基金；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校企合作項目(KX141111)

梅 冰(1982-),男，博士，主要從事固體廢物處理與處置方面的研究工作，E-mail：meibing11meibing@163.com

S216.4; X705

A

1000-1166(2016)01-0014-05