番茄JMJ524基因調控SlGLD1的DNA甲基化分析

楊偉 潘宇 蘇承剛 張興國 李金華

（西南大學園藝園林學院 南方山地園藝學重點實驗室，重慶 400715）

番茄JMJ524基因調控SlGLD1的DNA甲基化分析

楊偉 潘宇 蘇承剛 張興國 李金華

（西南大學園藝園林學院 南方山地園藝學重點實驗室，重慶 400715）

旨在分析番茄JMJ524基因如何通過影響SlGLD1 的DNA甲基化程度來調控其表達，從而導致番茄的赤霉素不敏感的矮化。利用生物信息學和BSP（Bisulfite sequencing PCR）分析JMJ524抑制系和野生型的SlGLD1的DNA甲基化程度。結果顯示，分離出SlGLD1的啟動子序列，發現其啟動子區域含有3個GA響應的順式作用元件；SlGLD1的啟動子區域和編碼區的DNA是高度甲基化的，而且在不同組織部位和突變體中的甲基化模式是不一樣的；在基因的編碼區發現了兩個GC島，推測SlGLD1的甲基化可能發生在基因的編碼區；針對這兩個GC島進行的BSP分析結果表明：SlGLD1的這兩個區段的DNA CpG是高度甲基化的，而且在JMJ524抑制系中，DNA的整體甲基化，特別是CpG甲基化程度顯著低于野生型對照M82。JMJ524抑制表達導致了SlGLD1的基因甲基化程度降低，從而激活這個基因的表達，可能是導致番茄植株矮化的一個因素。

JmjC；GLD1；DNA甲基化；番茄

組蛋白修飾、染色體重塑、DNA甲基化和小RNA介導的mRNA 降解等，這些表觀遺傳機制在調控相關基因的表達過程中具有很重要的作用和功能，而且是植物生長發育和對環境的適應過程中必

不可少的。其中DNA甲基化不僅在表觀途徑中調控著相關基因的表達，而且還會影響基因組的穩定性［1，2］。在原核生物中，DNA的甲基化是廣泛存在的，而在植物中根據甲基化模式、甲基化的分子機制和去甲基化酶的分類，DNA甲基化具有各種不同的特性［3］。哺乳動物中的DNA甲基化大部分發生在CpG位點，而且是由DNA甲基轉移酶DNMT1（DNA methyltransferase）和它的同源體催化的。但是，在植物中，DNA的甲基化不僅發生在CpG位點，還發生在CHG 和 CHH 位點，其中H 代表A、T或者C。例如，在擬南芥中，CpG、CHG 和 CHH 位點的甲基化分別是MET1（DNA methyltransferase 1）、CMT-3（chromomethylase 3）和DRMs（domains rearranged methyltransferases）這3種酶催化產生的［4］。

含有JmjC結構域的蛋白在動物中研究得比較多，主要起著組蛋白/DNA去甲基化的作用，在植物中的研究主要集中在擬南芥和水稻上，在番茄中還很少見相關基因的研究報道。動物中JmjC 蛋白分為JHDM1、PHF2/PHF8、JARID、JHDM3/JMJD2、UTX/UTY、JHDM2 和JmjC domain only 7個 亞 家族［5］。JmjC domain only 亞家族只含有JmjC結構域，其他亞家族不僅含有JmjC結構域，還含有ZFC2H2、F-Box、PHD、TPR 等結構域形成特定的酶活性。不同亞家族的JmjC蛋白作用位點存在特異性。全基因組的系統發育分析表明，水稻和擬南芥中分別有20個和21個編碼JmjC蛋白的基因［6］，其中擬南芥中已報道8個，具有廣泛的生物學功能［7］。通過番茄的基因組序列分析，我們發現番茄中共有5個編碼JmjC 蛋白的基因，其功能還都不清楚。前期的研究結果表明JMJ524 屬于 JmjC domain only亞家族，它的氨基酸序列與其他物種中具有較高的同源性，廣泛存在于很多物種中，且基因受到赤霉素（GA）的誘導表達。RNAi抑制表達JMJ524導致番茄的嚴重矮化，葉片變小皺縮，節間變短，生殖生長期植株皺縮矮化更加嚴重，而且這種矮化是GA不敏感的。通過對矮化植株和野生型對照進行RNA-seq轉錄組分析，我們發現兩個缺少N端的DELLA結構域的類DELLA蛋白SlGLD1（GRAS protein Lacking the DELLA domain）和SlGLD2基因在轉基因植株中有較高的表達［8］。番茄中至少有54個GRAS基因［9］，但是目前只有很少的GRAS基因的功能被鑒定出來，最近的研究表明這類基因在植物生長發育［10］和環境信號傳導［11］過程中具有很重要的作用。于是分別克隆了SlGLD1和SlGLD2這兩個基因并且通過轉基因的方法將其在番茄中超量表達，結果表明超量表達SlGLD1也導致番茄的矮化，而SlGLD2沒有明顯的矮化表型［8］。但是JMJ524是如何通過調控SlGLD1調節植物的生長發育等分子機理尚不清楚。本研究在前期結果的基礎上，分離和分析SlGLD1基因的啟動子序列，通過生物信息學的方法對基因的全長進行分析，利用已有的JMJ524抑制表達植株，探索JMJ524是否是通過調控SlGLD1基因的甲基化程度來調控基因的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

普通番茄番茄M82（Solanum lycopersicum cv. M82）和JMJ524-RNAi 轉M82抑制表達株系種植于西南大學科技樓溫室。

1.2 方法

1.2.1 SlGLD1 DNA甲基化位點分析和BSP（Bisulfite sequencing PCR）引物設計 根據前期我們克隆得到的SlGLD1（Solyc10g086380.1.1）的基因組序列，根據序列比對，在SGN（https://solgenomics.net）中查找其啟動子序列。得到-2 011 bp的SlGLD1啟動子序列，并用在線軟件（http://www.bioinformatics.org/ sms2/cpg_islands.html）預測GC島位置，設計引物運用在線BSP引物設計軟件（http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi），引物由華大基因科技服務有限公司合成，引物序列分別為SlGLD1BSP F1：5'-GTTGGAGAATTTAGAGTGGATTAAG-3'，SlGLD1BSP R1：5'-TTTCCATTTATATACAAAACCA ACAAC-3'；SlGLD1BSP F2：5'-TGGTTAGTATTTTTA TAGGTTTTTATTTTG-3'，SlGLD1BSP R2：5'-CCAA CACTTTCTCAATTACTCCTAAA-3'。SlGLD1啟動子序列和編碼序列在番茄各個部位的甲基化分析使用番茄的表觀遺傳數據庫［12］（http://ted.bti.cornell. edu/epigenome/）。

1.2.2 DNA的提取和重亞硫酸氫鹽修飾處理 用CTAB小量法［13］提取番茄矮化植株（Ri14）和野生

型（M82）葉片的DNA，DNA的重亞硫酸氫鹽修飾使用QIAGEN公司的EpiTect?Bisulfite試劑盒，操作步驟和實驗過程參照EpiTect?Bisulfite 操作手冊（2009版）。

1.2.3 BSP擴增和甲基化分析 處理完成后，分別用引物（SlGLD1BSP F1+SlGLD1BSP R1；SlGLD1BSP F2+SlGLD1BSP R2）對重亞硫酸氫鹽處理之后的DNA為模板進行PCR擴增，PCR程序如下：PCR反應體系20 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol/μL）0.4 μL，正反引物（100 μmol/L）各0.4 μL，DNA模板（300-500 ng/μL）1.0 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O補足20 μL。Buffer、dNTP和Taq酶購自Transgene公司。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃復性30 s，35個循環；72℃延伸 10 min，16℃保存 1 s。

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用E.Z.N.A?DNA凝膠回收試劑盒（Omega公司，美國）回收。回收純化的PCR片段與pMD18-T載體（寶生物工程大連有限公司）進行連接反應，體系中PCR插入片段與pMD18-T載體的摩爾比為3∶1連接，反應總體積是10 μL，16℃過夜連接。取10 μL連接產物，熱激法參照文獻［14］轉化大腸桿菌DH5α，在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，每個擴增產物挑取18-24個單克隆進行測序（由華大基因公司完成）。分析得到目的片段后，將序列和目標序列（未經過重亞硫酸鹽處理的DNA序列）輸入QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）和Kismeth（http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl）甲基化統計軟件計算甲基化程度。

2 結果

2.1 SlGLD1的啟動子和BSP甲基化位點分析

利用番茄基因組序列，分離得到SlGLD1的-2 011 bp的啟動子序列，我們發現啟動子序列含有3個GA響應的順式作用元件GARE（GA-responsive element），它的核心基序是TAACAAR［15］，分別在啟動子的-1 455、-822、-463處（圖1），說明SlGLD1可能是在GA調控途徑中發揮功能。為了進一步研究SlGLD1的DNA甲基化程度，我們發現在SlGLD1的編碼區有兩個GC島（圖2），但是在啟動子區域未發現GC島。因為DNA甲基化通常發生在GC島附近或者GC島上［16］，所以我們設計BSP引物，重點分析這兩個GC島和附近的DNA的甲基化程度。

圖1 SlGLD1啟動子區域GA響應的順式作用元件（紅色下劃線部分為GARE元件）

圖2 SlGLD1啟動子（A）和編碼序列（B）的GC島預測（陰影部分為GC島）

2.2 SlGLD1的啟動子和編碼區在番茄的各個部位的甲基化程序分析

將SlGLD1的基因序列在番茄表觀組數據庫比對發現，SlGLD1的啟動子序列和編碼區的DNA是高度甲基化的，如圖3所示，在果實成熟的時期，如17D（授粉后17 d）、MG（綠熟期）、Br（破色

期）、Br+10（破色后第10天），SlGLD1啟動子區域相對于編碼區甲基化程度要高，相反，在葉片中，SlGLD1編碼區的DNA甲基化程度較高。在CNR（colorless nonripening）突變體中，無論是在啟動子區域和編碼區，其DNA甲基化程度都相對在Rin（ripening-inhibitor）要高，這些都說明SlGLD1基因的DNA甲基化在番茄不同的器官中是有差異的，因此選擇葉片分析DNA甲基化程度，分析相應的編碼區可能會有更好的結果。

圖3 SlGLD1啟動子序列和編碼序列的在番茄相關組織和突變體中的DNA甲基化程度分析

2.3 SlGLD1基因的兩個甲基化熱點在JMJ524抑制系中甲基化程度分析

基于前面的結果，選取了編碼區的兩個GC島作為分析對象進行DNA甲基化分析。利用BS-PCR技術，用重亞硫酸鹽對JMJ524-RNAi 抑制系和WT（野生型M82）葉片的DNA 進行處理，然后利用引物對這兩個片段進行PCR擴增，克隆到T載體上進行測序分析。結果（圖4）顯示，利用重亞硫酸鹽處理后，轉化效率大于99%，以WT第2個GC島附近（1 164-1 400）為例，所得到的未甲基化的“C”經過處理擴增后全部變為“T”。我們選取那些轉化效率為100%的序列進行分析，結果表明在第1個GC島附近（728-1 039），野生型WT中CpG、CHG和CHH的總甲基化程度為77.92%、2.63%和1.51%，對應的在JMJ524-RNAi 抑制系中CpG、CHG和CHH 的甲基化程度分別為75.75%、1.75%和 1.41%，在野生型WT中的DNA甲基化程度明顯高于JMJ524-RNAi 抑制系（圖5-A和B）；同樣的在第2個GC島附近（1 164-1 400），野生型對照 WT CpG、CHG 和 CHH 的甲基化程度分別為63.81%、2.33% 和0.40%，在JMJ524-RNAi 抑制系中CpG、CHG 和 CHH 的甲基化程度分別為59.16%、1.49%和2.30%，除了CHH在RNAi抑制系中是提高的，其他類型的甲基化都降低了，其總甲基化程度在野生型WT中也是高于JMJ524-RNAi 抑制系（圖5-C和D）。特別是CpG類型的甲基化，在這兩個甲基化熱點都是顯著降低的，如圖6所示，在第2個GC島位置，編碼區的1 189、1 284、1 303、1 355和1 365這些位點的DNA CpG甲基化程度在Ri14中都比WT低。結合以上結果，說明JMJ524可能是通過

調控植物基因組的甲基化程度，使SlGLD1的DNA CpG的甲基化降低，從而激活這個基因的表達，導致番茄的矮化。

圖4 重亞硫酸鹽處理SlGLD1基因序列前后測序結果分析（Target為處理前目標序列：1 164-1 400）

圖5 SlGLD1編碼區的兩個甲基化熱點的DNA甲基化分析

圖6 SlGLD1編碼區在JMJ524抑制系（Ri14）和野生型（WT）的甲基化比較分析

3 討論

本研究中，我們發現SlGLD1的啟動子序列含有3個GA響應的順式作用元件（圖1），印證了SlGLD1這類GRAS基因是參與GA調控途徑的［17］，這也與我們前期發現其受到GA誘導表達是一致的。但是通過生物信息學分析，我們并沒有在其啟動子區域發現甲基化熱點，反而在其編碼區發現兩個甲基化熱點（圖2），由于JmjC類基因在很多報道中已經證明參與植物的DNA甲基化或者組蛋白修飾［18-20］，所以推測JMJ524調控基因的表達可能是通過表觀遺傳的機制進行的。表觀遺傳的研究已成為生命科學研究的前沿和熱點，其主要研究在基因的核苷酸序列沒有發生改變的情況下，基因的功能發生了可遺傳性變化，并最終導致表型的變化。隨著分子生物學的發展，表觀遺傳的研究發展也越來越快，然而總體來說，植物中的表觀遺傳研究遠落后于動物，也主要集中在擬南芥和水稻中，番茄作為一種重要的模式作物的研究更是遠遠不夠。隨著基因組測序的完成以及豐富的遺傳資源使番茄成為表觀遺傳學研究的重要對象。

表觀遺傳的機制較復雜，包括染色質重塑、基因組印跡、基因表達的重編程、DNA甲基化及RNA干擾等。染色質重塑常因染色質核心組蛋白發生甲基化、乙酰化等共價修飾，從而改變染色質的結構并影響基因的轉錄表達。組蛋白的甲基化發生在賴氨酸和精氨酸上，能調控一系列生物學過程，包括基因活性、染色質結構、劑量補償效應及表觀遺傳學記憶［21］。DNA甲基化、組蛋白甲基化和染色體重塑之間也是相互影響，通過控制染色質的結構從而調控相關基因的表達［22］。本研究對已獲得了番茄的JMJ524基因RNAi沉默的轉基因植株和野生型對照，并且進一步進行BSP甲基化分析發現，JMJ524的抑制系中SlGLD1的CpG甲基化程度比野生型明顯降低（圖5和6），雖然CHG和CHH的甲基化程度也有所降低，但是甲基化程度不高，所以推測JMJ524對基因的調控可能主要是控制CpG的甲基化。上述結果確定JMJ524的抑制表達影響了SlGLD1基因編碼區的DNA甲基化程度，特別是CpG的甲基化程度，從而調控這個基因表達，這與我們前期通過HPLC發現抑制表達JMJ524后影響植物全基因組甲基化水平是一致的［8］。在JMJ524抑制系中，SlGLD1是上調表達的，而且超量表達SlGLD1也導致了番茄的不敏感的矮化，但是SlGLD1的矮化沒有JMJ524-RNAi抑制系嚴重，所以推測，JMJ524可能不只是調控SlGLD1來影響植物的生長發育，還調控其他的靶基因或影響其他基因的甲基化來行使其功能。

4 結論

本研究分別對JMJ524-RNAi轉基因植株和野生型M82的SlGLD1基因的DNA序列進行了甲基化的分析，結果表明在SlGLD1 DNA序列中有兩個GC島，而且通過預測發現這兩個片段的序列是高度甲基化的。利用BSP分析這兩個片段，結果表明在JMJ524-RNAi轉基因株系中，DNA的整體甲基化程度，特別是CpG的甲基化程度顯著低于野生型對照M82。

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（責任編輯 馬鑫）

Analysis of the DNA Methylation of SlGLD1 Regulated by JMJ524 in Tomato

YANG Wei PAN Yu SU Cheng-gang ZHANG Xing-guo LI Jin-hua
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwestern University，Key Laboratory of Horticultural Science in Southern Mountainous Region，Chongqing 400715）

This work is to reveal the mechanism of JMJ524 modulatinges the SlGLD1 expression by affecting the DNA methylation of SlGLD1，and leading to the dwarf of tomato insensitive to gibberellin. Bioinformatics and BSP（Bisulfite sequencing PCR）were employed to analyze the DNA methylation of SlGLD1 in inhibitory line and wild line of JMJ524. Results showed that the SlGLD1 promoter sequence was isolated，which contained 3 GA response cis-elements. The DNAs of SlGLD1 promoter and coding sequence were highly methylated，moreover，the methylation pattern varied at the different tissues and mutants. Two GC islands were found in this coding region of the gene，thus it was inferred that the methylation of SlGLD1 might happen in the region. Further，the analysis by BSP of the 2 GC islands indicated that the DNA CpG in the 2 regions of SlGLD1 was highly methylated. The whole methylation of DNA in the inhibitory line of JMJ524，especially CpG methylation was significantly lower than wild-type M82. The inhibited expression by JMJ524 resulted in the decrease of gene methylation of SlGLD1，therefore the expression of the gene was activated，which might be the one of factors causing the dwarf of tomato plant.

JmjC；GLD1；DNA methylation；tomato

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.014

2016-05-12

國家自然科學基金項目（31301779），重慶市基礎與前沿研究計劃一般項目（cstc2015jcyjA80030），中央高校基本業務費專項基金項目（XDJK2014B045，XDJK2016E148）

楊偉，男，碩士研究生，研究方向：蔬菜分子生物學與基因工程；E-mail：shucaiyuanyi@163.com

李金華，男，博士，研究方向：蔬菜分子生物學與基因工程；E-mail：ljh502@swu.edu.cn