版納微型豬近交系CATSPER3基因克隆、序列及發育進化分析

肖晶查星琴，成文敏，霍金龍，潘偉榮，王淑燕，王配，劉海京張秀瓊曾養志

（1. 云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；2. 云南農業大學 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201）

版納微型豬近交系CATSPER3基因克隆、序列及發育進化分析

肖晶1查星琴1，2成文敏1，2霍金龍1，2潘偉榮1，2王淑燕1，2王配1，2劉海京2張秀瓊2曾養志2

（1. 云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201；2. 云南農業大學 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201）

獲得版納微型豬近交系（BMI）CATSPER3基因部分編碼區序列，通過生物信息學分析其氨基酸序列和進行不同物種間的同源性比較。以版納微型豬近交系的公豬睪丸為材料提取RNA，RT-PCR方法擴增CATSPER3基因部分編碼區序列，利用在線分析軟件進行生物信息學分析。結果顯示，擴增出CATSPER3基因部分編碼區序列。生物信息學分析表明，推導氨基酸序列，編碼蛋白分子量為19.397 3 kD，理論等電點為5.05；在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有24個、堿性氨基酸（Lys+Arg）有16個，其中以亮氨酸（Leu）占13.3%、纈氨酸（Val）占9.6%、蘇氨酸（Thr）占9.0%、苯丙氨酸（Phe）占8.4%、谷氨酸（Glu）占7.2%，天冬氨酸（Asp）占7.2%等含量較高。在核苷酸相似度上與普通豬相似度最高，與山羊核苷酸的相似度較低；分子系統進化樹表明與非近交系豬同處于一個分支中，親緣關系較近，與山羊和綿羊親緣關系較遠。

版納微型豬近交系；CATSPER3基因；系統進化分析

近年來許多相關研究發現，精子在獲能和超活化過程中會出現大量鈣離子內流，說明它是精子質膜上控制鈣離子內流的通道，精子頭部和尾部存在一種離子蛋白，對精子的運動能力、穿卵能力以及受精能力都有一定的影響。CATSPER通道是已知的僅存于生精細胞和成熟精子中的Ca2+離子通道，通過基因剔除發現這類通道直接與精子的運動和受精能力有關。早期研究表明Ca2+離子通道蛋白家族（Canon channel of sperm ptoreins Catsper）由4個成員（CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3和CATSPER4）組成［1，2］，而后又發現Ca2+離子通道蛋白的新成員Catsper β和CatsperG［3，4］。

Ca2+離子通道蛋白的表達是睪丸特異的，在睪丸以外的其他器官及免疫系統如大腦、心臟、脾、腎、胃、骨骼中皆不表達。其中CATSPER3主要定位于精子頭部［1，3］，而AMP和Ca2+都能誘導頂體反應的發生，因此推測CATSPER3可能參與頂體反應中胞內Ca2+濃度的調節。版納微型豬近交系是世界上第一個培育成功的大型哺乳類實驗動物近交系，CATSPER3基因是Ca2+離子通道蛋白家族的重要成員之一，本研究擬采用反轉錄PCR的方法擴增得到版納微型豬近交系豬CATSPER3基因的序列，結合多種生物信息學分析軟件分析，以期能夠解釋版納微型豬近交系豬弱精癥產生的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA純化試劑盒，購自全式金生物技術有限公司；病毒總RNA/DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、RT-PCR一步法試劑盒、Taq酶、DL2000 DNA Marker、Competent Cell Preparation Kit，逆轉錄酶XL（AMV）、Ta-KaRa Ex TaqTM均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考GenBank上豬CATSPER3的全基因序列設計的引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增的特異性片段長度約為498 bp。引物序列為：5'-GCCTTCTTTACCCTCTTCAGC-3'；5'-AAGTATCAGGCTCGGCACAT-3'。

1.2.2 RNA的提取、cDNA合成 參照 RNA Plus的使用方法，從版納微型豬近交系睪丸組織中提取總RNA，經過核酸蛋白測定儀檢測出總RNA的濃度和純度，根據測定的濃度將RNA稀釋成200 ng/μL，取5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將檢測合格的RNA樣品反轉錄為cDNA，反轉錄體系（20 μL）：50 μmol/L oligo（dT）181 μL，總RNA 1 ng-5 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，加入滅菌蒸餾水至12 μL，混合后65℃加熱5 min，迅速冰浴冷卻；短暫離心后加入：5×first buffer 4 μL，0.1 mol/L的DTT 2 μL，recombiant RNase inhibitor 1 μL，輕輕將各組分混合，37℃孵育 2 min，室溫下加入1 μL reverse transcriptase M-ML，輕輕吹打混勻，37℃孵育5 min，70℃加熱15 min以終止反應，產物置-20℃儲存備用。

1.2.3 CATSPER3基因PCR擴增 PCR反應體系25 μL：Premix Taq 13.0 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，DNA模 板（25 ng/μL）1.5 μL， 加 ddH2O（高壓滅菌雙蒸水）補足至25 μL。PCR反應程序為：95℃5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 7 min，4℃保存。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統（SYGENE，GeneGenius）中觀察分析并照像。

1.2.4 CATSPER3基因克隆 應用全式金生物技術有限公司DNA純化回收試劑盒（離心柱型）進行PCR產物純化（步驟參照說明書），將純化后檢測正確的PCR產物連接入pMD18-T克隆載體，轉化DH5α感受態細胞，涂布瓊脂糖平皿上，恒溫培養箱37℃過夜培養，進行藍白斑篩選，用白色吸頭挑取白色單克隆菌落，接種入LB液體培養基，37℃，200 r/min震蕩過夜培養，吸取微量過夜菌液進行菌液PCR鑒定，檢測后送往上海生物工程技術有限公司測序。

1.2.5 CATSPER3基因序列的生物信息學分析 測序得到的結果用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的Nucleotide Blast軟件檢驗核苷酸的序列；然后用Generunr軟件預測出開放閱讀框，并得到相應的氨基酸序列；用在線分析軟件ExPASy-PrtPram tool分析CATSPER3基因編碼蛋白質的結構；通過NetNGlyc 1.0 Server預測蛋白質N-糖基化位點；通過NetOGlyc 4.0 Server預測蛋白質O-糖基化位點；通過NetPhos 2.0 Server預測蛋白質

磷酸化位點；通過SignalP 4.1 Server預測信號肽序列；通過TMpred server預測蛋白質中是否有跨膜結構域；用SOPMA方法預測蛋白質的二級結構；用Lasergene軟件分析核苷酸的同源性。

2 結果

2.1 CATSPER3基因擴增結果

CATSPER3引物擴增的特異性片段為498 bp，與預期片段大小一致（圖1）。測序結果與GenBank上豬CATSPER3基因序列比對，確定擴增序列為BMI的CATSPER3基因序列。

圖1 CATSPER3引物擴增的PCR產物電泳結果

2.2 CATSPER3基因序列生物信息學分析

用ExPASy ProtParam程序預測CATSPER3基因編碼蛋白分子量為19.397 3 kD，理論等電點為5.05；在氨基酸組成上，在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有24個；堿性氨基酸（Lys+Arg）有16個；其中，亮氨酸（Leu）占13.3%、纈氨酸（Val）占9.6%、蘇氨酸（Thr）占9.0%、苯丙氨酸（Phe）占8.4%、谷氨酸（Glu）占7.2%、天冬氨酸（Asp）占7.2%等含量較高。CATSPER3蛋白質不穩定指數為39.46，屬于穩定蛋白；脂溶指數為103.80，總的親水性平均系數（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為0.020，具有弱親水性。采用SignalP 4.1對CATSPER3蛋白進行預測（圖2）表明，CATSPER3蛋白沒有信號肽位點；用NetOGly 4.0和NetNGly 1.0進行預測的結果表明，CATSPER3蛋白中不含有N-糖基化位點和O-糖基化位點。

NetPhos2.0預測（圖3）表明，CATSPER3蛋白存在7個磷酸化位點，其中3個絲氨酸（Ser）磷酸化位點（A29、A59、A139）、3個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點（A74、A96、A115）、1個酪氨酸（Tyr）活性位點（A156）。CATSPER3的蛋白存在著較多的磷酸化位點，說明磷酸化位點修飾對CATSPER3的蛋白活化起著重要作用。

圖2 CATSPER3蛋白跨膜信號肽位點預測

圖3 CATSPER3蛋白磷酸化位點推測圖

用SOPMA方法預測的CATSPER3蛋白的二級結構結果（圖4）顯示，參與α-螺旋的氨基酸有94個，含量達56.63%；有35個氨基酸參與延伸鏈，占21.08%；10個氨基酸可能參與β-轉角，占6.02%；27個氨基酸可能參與無規則卷曲，占16.27%。以上分析可推測，α-螺旋是CATSPER3蛋白的主要結構。

測序結果經GenBank上Nucleotide Blast，結果（圖5）顯示，在第970位核苷酸位置有一個堿基由G變成C，在第1 243位核苷酸位置有一個堿基由C變成T。測序獲得序列與參考序列推導氨基酸序列，結果（圖6）顯示，在核苷酸突變的位置氨基酸未改變，屬于無意義突變。

圖4 SOPMA程序預測BMI CATSPER3蛋白二級結構

圖5 CATSPER3基因核苷酸序列比對

圖6 CATSPER3基因推導氨基酸序列比對

在NCBI中下載CATSPER3基因各物種的相關序列，通過lasergene軟件編輯格式，比對得出圖7，圖8。圖7顯示，版納微型豬近交系豬與普通豬核

苷酸相似度較近為99.6%，與山羊相似度較低為88.6%，從進化樹圖8中也可以得出相似的結論，版納微型豬近交系豬與普通豬同處于一個分支中，而與山羊和綿羊在進化樹中距離最遠。

圖7 CATSPER3基因核苷酸相似度分析

圖8 CATSPER3基因系統進化樹分析

3 討論

CatSper是睪丸內生殖細胞中特異的離子型通道，定位于精子尾部鞭毛的主段，由于主段沒有細胞器，因此推測 CATSPER1和 CATSPER2主要定位于主段的質膜上，對鞭毛鞭打運動起調節作用；而 CATSPER3表達于精子頂體，可能參于精子頂體反應和生殖調節［5］。Qi等［5］研究表明，CATSPER3也參與精子超活化的調控，且CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3和CATSPER4四個蛋白都對受精有影響［6］。

本實驗擴增的序列長度為498 bp，包含部分編碼區和部分非編碼區，對測序結果分析，在第970位和第1 243位核苷酸位置分別有一個堿基由G變成C和C變成T，但在該位置氨基酸卻沒有改變，屬于無意義突變。

在推導的氨基酸序列中無跨膜結構和信號肽，含有7個磷酸化位點，其中3個絲氨酸（Ser）磷酸化位點（A29、A59、A139）、3個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點（A74、A96、A115）、1個酪氨酸（Tyr）活性位點（A156），推測可能在這一段序列推導的二級結構中，磷酸化位點對其的修飾和調控作用占主要方面；參與α-螺旋的氨基酸有94個，含量達到56.63%；有35個氨基酸參與延伸鏈，占21.08%；10個氨基酸可能參與β-轉角，占6.02%；27個氨基酸可能參與無規則卷曲，占16.27%。推測α-螺旋是該段推導CATSPER3蛋白的主要結構。核苷酸相似度的比較中與普通豬相似度最高，與山羊相似度較低，這與楊媛媛［7］的研究結果一致，CATSPER3在進化上比較保守，核苷酸物種間相似性較高；在親緣關系上與普通豬同處于一個分支，親緣關系較近，與山羊和綿羊親緣關系較遠，與預期結果一致。

4 結論

成功擴增了CATSPER3基因部分編碼區序列，特異性片段為498 bp。版納微型豬近交系豬與非近交系豬核苷酸相似度為99.6%，與山羊相似度為88.6%。版納微型豬近交系豬與非近交系豬同處一個分支，親緣關系較近，與山羊和綿羊親緣關系較遠。

［1］Darszon A, Acevedo JJ, Galindo BE, et al. Sperm channel diversity and functional multiplicity［J］. Reproduction, 2006, 131（6）：77-88.

［2］Inaba K. Molecular architecture of the sperm flagella：molecules for motility and signaling［J］. Zoolog Sci, 2003, 20（9）：1043-1056.

［3］Liu J, Xia J, Cho KH, et al. CatSperbeta, a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex［J］. J Biol Chem, 2007, 282（26）：18945-18952.

［4］Wang H, Liu J, Cho KH, Ren D. A novel, single, transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPERI channel protein［J］. Biol Reprod, 2009, 81（3）：539-544.

［5］Jin JL, O’Doherty AM, Wang S, et al. Catsper3 and catsper4 encode two canon channel-like proteins exclusively expressed in the testis［J］. Biol Reprod, 2005, 73（6）：1235-1242.

［6］ Qi H, Moran MM, Navarro B, et al. All four CatSper ion channel proteins are required for male fertility and sperm cell hyperactivated motility［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104（4）：1219-1223.

［7］楊媛媛, 王根林. 精子超活化結構蛋白-Catsper表達特性的研究［D］. 南京：南京農業大學, 2006.

（責任編輯 李楠）

Cloning，Sequence and Phylogenetic Analysis of CATSPER3 Gene in Banna Mini-pig Inbred Line

XIAO Jing1ZHA Xing-qin1，2CHENG Wen-min1，2HUO Jin-long1，2PAN Wei-rong1，2WANG Shu-yan1，2WANG Pei1，2LIU Hai-jing2ZHANG Xiu-qiong2ZENG Yang-zhi2
（1. Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201；2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Our purpose of this work is to obtain the partial coding region sequences of CATSPER3 gene from Banna Mini-pig Inbred Line（BMIL），and to analyze the amino acid sequence and homology comparison among different species by bioinformatics. We used boar testis material of BMIL to extract RNA，RT-PCR to amplify the coding sequence of CATSPER3 gene，and online analysis software to analyze the bioinformatics. Bioinformatics analysis showed that the protein molecular weight of deduced amino acid sequence was 19.397 3 kD and theoretical isoelectric point was 5.05. Regarding the composition of amino acid，there were 24 acidic amino acids（Asp and Glu）；and there were 16 alkaline amino acid（Lys+Arg）；among them the leucine（Leu）accounted for 13.3%，valine（Val）9.6%，threonine（Thr）9.0%，phenylalanine（Phe）8.4%，glutamate（Glu）7.2%，aspartic acid（Asp）7.2%，and their contents were high. Compared with ordinary pig，the nucleotide similarity was the highest，however，lower with that of goat. Molecular phylogenetic tree showed that inbred pig and noninbred pig clustered in the same branch，i.e.，their genetic relationship was close，while far from goat and sheep.

Banna Mini-pig Inbred Line；CATSPER3 gene；phylogenetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.017

2016-01-11

云南省教育廳科學研究基金項目（2014Y212）

肖晶，男，碩士，研究方向：分子生物學研究，E-mail：xiaojingjing525@163.com；查星琴為本文并列第一作者

潘偉榮，男，碩士，研究方向：胚胎生物技術；E-mail： pwr2000@sina.com