地被銀樺試管苗增殖培養(yǎng)研究

李湘陽　曾炳山　裘珍飛

摘 要 地被銀樺是雜交品種，無性繁殖對保持地被銀樺的品種特性至關(guān)重要。本研究以組織培養(yǎng)為繁殖方法，從激素的濃度、種類、大量元素及糖等方面對地被銀樺的增殖培養(yǎng)進行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，6-BA的濃度對增殖苗的高度有顯著影響，6-BA和IBA對試管苗的玻璃化比例均有顯著影響，NH4NO3和KH2PO4的濃度也顯著影響增殖苗的高度。最適增殖培養(yǎng)基配方為：改良MS培養(yǎng)基（NH4NO3 412.5 mg/L ，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

關(guān)鍵詞 地被銀樺 ；組織培養(yǎng) ；增殖

中圖分類號 Q813.1 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.007

Abstract Grevillea Billy Bonkers is a hybrid Grevillea. Vegetative propagation plays an important role in keeping varietal characteristics of Billy Bonkers. Billy Bonkers was mass proliferated via tissue culture， and the hormones and their concentrations， macro-elements and sugar were modified to develop an optimal MS medium for tissue culture of Billy Bonkers. The results indicated that the concentrations of 6BA， NH4NO3 and KH2PO4 had significant effect on plantlet height growth of Billy Bonkers. The 6BA and IBA had significant effect on plantlet vitrification ratio. The optimal medium for tissue culture is （NH4NO3 412.5 mg/L， KH2PO4 85 mg/L） + 6BA 0.3 mg/L + IBA 0.1 mg/L + sugar 35 g/L.

Keywords Grevillea Billy Bonkers ； tissue culture ； proliferation

銀樺屬植物（Grevillea）是山龍眼科（Proteaceae）能綻放大型花序的植物，原產(chǎn)于澳大利亞、新幾內(nèi)亞、新喀里多尼亞島和印度尼西亞中部的蘇拉威西島。地被銀樺不僅花型好看、顏色艷麗、花期長、具有很高的觀賞價值，而且耐旱能力強，應(yīng)用于庭院綠化和景觀工程的管護成本低，具有較好的市場前景。然而地被銀樺是一個雜交種，難以獲得正常種子，而且種子繁殖也難以保持雜交品種的優(yōu)良特性，只有通過無性繁殖方式（如組織培養(yǎng)、扦插繁殖）獲得的種苗才能保證母本植物的優(yōu)良特性。目前已有部分銀樺屬觀賞植物的組織培養(yǎng)取得成功，如白翅銀樺（G. leucopteris）[1]、綿毛銀樺（G. lanigera）[2]、莫麗銀樺（G. molly）[3]、月光銀樺（G. moonlight）[4]等，但地被銀樺的組織培養(yǎng)研究尚未見報道。本課題組開展了地被銀樺的組織培養(yǎng)研究，建立了一套成熟的試管苗繁殖體系，為地被銀樺的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所苗圃。

1.2 方法

1.2.1 采集外植體

選降雨量較少的6～9月取材，在天氣持續(xù)晴朗5天后，于上午9點～10點，采集新萌條的頂梢25～30 cm，剪去葉片后將其放入干凈保鮮袋中，并及時帶回實驗室進行消毒處理。

1.2.2 外植體消毒

用洗衣粉溶液浸泡枝條30 min，然后在自來水下沖洗干凈；將枝條切成3～4 cm長、帶1～2個葉腋的莖段，在超凈工作臺上用0.1%的HgCl2浸泡消毒3～7 min，期間不斷搖動確保消毒液與枝條充分接觸；然后用無菌水清洗4次，每次5 min。

1.2.3 叢芽誘導與繼代增殖培養(yǎng)

將莖段兩端各切去0.5 cm，留下中間含葉腋的莖段作為無菌外植體，將其接種到叢芽誘導培養(yǎng)基上；誘導3～5個月，形成叢芽后，將其轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基上進行增殖和擴繁。

1.2.4 激素對增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于8種含不同濃度6-BA和IBA的培養(yǎng)基中（1）：6-BA 0.2 mg/L；（2）：6-BA 0.3 mg/L；（3）：6-BA 0.4 mg/L；（4）：6-BA 0.5 mg/L；（5）6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（6）6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（7）6-BA 0.4 mg/L+IBA 0.1 mg/L；（8）6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。每種培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度均為1/4 MS，KH2PO4的濃度均為1/2 MS，每個處理重復(fù)10瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.5 NH4NO3對增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度NH4NO3（0 MS、1/4 MS、1/2 MS、1 MS）的增殖培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.6 KH2PO4對增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度KH2PO4（1/4 MS、1/2 MS、3/4 MS、1 MS）的增殖培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

1.2.7 蔗糖對增殖苗的影響

將地被銀樺試管苗分別接種于含不同濃度糖（30、35、40、45 g/L）的增殖培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)6瓶，每瓶接4株試管苗。

以上各組實驗所用培養(yǎng)基中均添加瓊脂粉6 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間12 h/d，光照強度2 000 lx。所有處理均培養(yǎng)4周，之后統(tǒng)計試管苗的高度、增殖率及玻璃化苗比例。受污染影響，試驗結(jié)束時可測定的重復(fù)數(shù)不等。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SAS軟件進行不等重復(fù)試驗方差分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對增殖苗的影響

試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的6-BA濃度影響地被銀樺試管苗的增殖倍數(shù)。隨著6-BA濃度的升高，增殖倍數(shù)逐步上升（圖1），但同時試管苗的高度在迅速下降（圖2），玻璃化苗比例上升（圖3）。方差分析顯示，6-BA濃度的變化對地被銀樺增殖倍數(shù)的影響在不同處理間差異不顯著（表1），但試管苗的高度在不同處理間表現(xiàn)出極顯著差異（表2），玻璃化苗比例也表現(xiàn)出顯著差異（表3）。

IBA對增殖苗的影響是雙向的。一方面培養(yǎng)基中加入IBA后增殖倍數(shù)普遍表現(xiàn)為上升的趨勢（圖1），但差異不顯著（表1）；另一方面IBA的加入也導致試管苗玻璃化的比例顯著上升（圖3），且不同處理間表現(xiàn)出顯著差異（表3）。IBA對試管苗的高度有一定影響，即在加入IBA后，盡管試管苗的高度也會隨著6-BA濃度的升高而下降，但下降的幅度會減少（圖2），且不同處理間的差異不顯著（表2）。

雖然方差分析表明6-BA與IBA的聯(lián)合作用對地被銀樺試管苗的增殖倍數(shù)、高度及玻璃化比例的影響在不同處理間差異不顯著（表1～3），但實際的數(shù)據(jù)顯示，當培養(yǎng)基中加入少量IBA后，在培養(yǎng)基中6-BA濃度相同的情況下，增殖倍數(shù)都略有升高（圖1），IBA會減緩因6-BA濃度的升高而導致的試管苗高度下降（圖2），同時IBA有加劇試管苗玻璃化的傾向（圖3）。綜合考慮增殖倍數(shù)、試管苗高度及玻璃化的狀況， 認為6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基配方比較適合地被銀樺試管苗的增殖培養(yǎng)。

2.2 NH4NO3濃度對增殖苗的影響

培養(yǎng)基中的NH4NO3濃度的變化導致試管苗高生長量發(fā)生巨大變化（圖4）。方差分析表明，NH4NO3對地被銀樺試管苗高生長有極顯著影響（表4）。當培養(yǎng)基中NH4NO3的濃度為0時，試管苗的平均苗高生長為1.64 cm；但當NH4NO3的濃度增至825 mg/L（1/2 MS）時，試管苗高生長量卻降至0.94 cm，不過加入少量的NH4NO3（412.5 mg/L）（1/4 MS）對地被銀樺試管苗高生長還是有促進作用的。

2.3 KH2PO4濃度對增殖苗的影響

培養(yǎng)基中KH2PO4的濃度對地被銀樺試管苗高生長有重要影響（圖5）。當KH2PO4濃度太低時（42.5 mg/L，即1/4 MS），試管苗普遍矮小，平均苗高生長量只有0.38 cm；當KH2PO4濃度上升至85 mg/L（1/2 MS）時，試管苗平均苗高生長量隨即升高至1.96 cm，但當繼續(xù)提高KH2PO4濃度至127.5 mg/L（3/4 MS）時，試管苗高度又開始下降，可見地被銀樺試管苗對P也是比較敏感的，適合用偏低濃度的P進行組織培養(yǎng)。方差分析顯示，KH2PO4對地被銀樺試管苗的苗高生長量有極顯著影響（表5）。

2.4 蔗糖對地被銀樺試管苗的影響

適當增加培養(yǎng)基中蔗糖的濃度，能提高地被銀樺試管苗的高度，但如果蔗糖濃度過高，試管苗的高度又會下降（圖6）。這說明蔗糖作為地被銀樺試管苗組織培養(yǎng)中的碳源對試管苗的生長起著比較重要的作用，合適的濃度能促進試管苗的生長，但濃度過高可能改變了培養(yǎng)基的滲透環(huán)境，影響了試管苗對其它物質(zhì)的吸收，從而導致試管苗高生長量下降。方差分析表明，蔗糖對試管苗高生長量的影響差異不顯著（表6）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

一般認為，6-BA在培養(yǎng)基中的作用是誘導芽的分化及促進側(cè)芽萌發(fā)生長[5]。在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，試管苗的增殖倍數(shù)會升高[6-9]。地被銀樺主要是以側(cè)芽萌發(fā)的方式進行繁殖，提高6-BA的濃度能促進試管苗的增殖，但卻導致試管苗的高度下降，在高粱泡組培研究中也發(fā)現(xiàn)類似的情況[6]。IBA是生長素類激素，通常認為其在組織培養(yǎng)中能促進細胞分裂和細胞伸長生長[5]，往培養(yǎng)基中加入IBA后，在6-BA濃度相同的情況下，地被銀樺試管苗的高度有所增加。在對山新楊[7]、變?nèi)~金銀木[10]進行組織培養(yǎng)研究時也發(fā)現(xiàn)，適當濃度的生長素類激素能提高芽苗的高度。

Mujib等[11]認為，BA是組培試管苗玻璃化的根源。徐涌等[12]在研究吳茱萸組織培養(yǎng)時證明，適當質(zhì)量濃度的6-BA能提高增殖率，但質(zhì)量濃度過高則容易導致玻璃化。本研究結(jié)果也表明，6-BA是影響試管苗玻璃化率的重要因子，同時IBA也對地被銀樺試管苗的玻璃化有顯著影響，這說明無論是細胞分裂素還是生長素類激素都對試管苗的玻璃化有顯著影響。莫麗銀樺[3]、月光銀樺[4]的組織培養(yǎng)研究結(jié)果也證明，6-BA、NAA、IBA濃度的上升容易導致組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在其它植物如鐵線蓮[13]、洋桔梗[14]的組培研究中也表明，當6-BA相同濃度時，提高生長素類激素濃度會增加試管苗玻璃化比例。

MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基，大多數(shù)植物都能在MS培養(yǎng)基上較好地生長，但是銨對不少培養(yǎng)物有抑制生長的作用[15]。劉正娥等[16]在研究孝順竹的組培快繁時發(fā)現(xiàn)，當NH4NO3在0～2 475 mg/L時，苗高隨著濃度的升高有所下降；當KH2PO4在85～255 mg/L時，苗高隨濃度的升高而增加，其中濃度為255 mg/L時苗高最高，之后隨其濃度的升高而下降。MS培養(yǎng)基中蔗糖的標準濃度是3%[15]，然而不同的植物對碳源的需求并不一樣。李林等[17]研究了蔗糖濃度為10～50 g/L時對美國黃松不定芽增殖和生長的影響，證明不定芽的增殖率在蔗糖濃度為20 g/L時最大，之后隨著蔗糖濃度的增加而下降。周遜等[18]在研究遵義大白姜的組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，當蔗糖濃度為0～100 g/L時，隨著蔗糖濃度的升高，大白姜的生長量直線上升，但繼續(xù)升高蔗糖濃度后，試管苗的生長開始受到抑制。因此，采用MS培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)時有必要根據(jù)試管苗的狀況進行適當?shù)恼{(diào)整。本研究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中不同濃度的NH4NO3和KH2PO4對地被銀樺試管苗生長的影響均達到極顯著差異水平，較高濃度的NH4NO3和KH2PO4均會抑制地被銀樺試管苗高生長，而將培養(yǎng)基中糖的濃度提高到3.5%時，試管苗的生長量會上升。所以，在對地被銀樺進行組織培養(yǎng)時，應(yīng)采用較低濃度的NH4NO3和KH2PO4，并適當提高糖的濃度。

3.2 結(jié)論

地被銀樺在進行組織培養(yǎng)時容易出現(xiàn)試管苗玻璃化現(xiàn)象，而激素濃度對試管苗的玻璃化有顯著影響，因此只能采用較低濃度的激素組合。另外，地被銀樺試管苗的生長量受到激素濃度、NH4NO3和 KH2PO4含量以及蔗糖濃度的影響，必須對常規(guī)MS培養(yǎng)基進行改良才能保證試管苗的正常生長。最適增殖培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基（NH4NO3 412.5 mg/L，KH2PO4 85 mg/L）+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.1 mg/L+糖35 g/L。

參考文獻

[1] 趙平麗，奚如春，葉小玲，等. 白翅銀樺組培快繁技術(shù)研究[J]. 江西林業(yè)科技，2011（3）：12-15.

[2] 龔 崢，張衛(wèi)華，張方秋，等. 綿毛銀樺的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2014（2）：57-60.

[3] 張曉明，陳 葉，鄧小梅，等. 莫麗銀樺組培技術(shù)研究[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2013，27（1）：101-104.

[4] 焦金鳳，張曉明，鄧小梅，等. 月光銀樺組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2015，29（6）：73-76.

[5] 朱建華，彭士勇. 植物組織培養(yǎng)實用技術(shù)[M]. 北京：中國計量出版社，2002：27-28.

[6] 李海燕，王小敏，李維林，等. 高粱泡組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 經(jīng)濟林研究，2010，28（1）：51-55.

[7] 王紅蕾. 山新楊高效組培再生體系的建立[J]. 北方園藝，2010（13）：174-175.

[8] 單 琳，楊 玲，沈海龍. 花曲柳莖芽增殖和植株再生[J]. 經(jīng)濟林研究，2011，29（4）：54-59.

[9] 陳雪鵑，吳 玨，李雪珂，等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2012，32（7）：100-104.

[10] 石進朝，陳蘭芬，王 晶，等. 變?nèi)~金銀木組織培養(yǎng)研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2011，31（6）：116-121.

[11] Mujib A， Pal A K. Inter-varietal variation in response to in vitro cloning of carnation[J]. Crop Research Hisar， 1995， 10： 190-194.

[12] 徐 涌，孫駿威，陳 珍. 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)處理對吳茱萸組織培養(yǎng)的影響[J]. 浙江農(nóng)林大學學報，2011，28（3）：500-504.

[13] 袁 佳，胡恒康，方炎明，等. 不同培養(yǎng)條件對鐵線蓮不定芽增殖及玻璃化的影響[J]. 西北植物學報，2011，31（2）：401-406.

[14] 孫慧晶，李建賓，希從芳，等. 兩種植物生長調(diào)節(jié)劑對洋桔梗離體培養(yǎng)的效應(yīng)半[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，29（2）：208-215.

[15] 沈惠娟. 木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1992：16.

[16] 劉正娥，朱 顏，樓 崇. 大量元素組成對孝順竹苗組培快繁的影響[J]. 竹子研究匯刊，2012，31（1）：46-51.

[17] 李 林，黃忠良，唐德瑞，等. 蔗糖、活性炭對美國黃松不定芽增殖和生長的影響[J]. 福建林學院學報，2005，25（3）：260-263.

[18] 周 遜，徐曉舒，潘 輝，等. 蔗糖濃度對遵義大白姜試管姜誘導的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（24）：5 256-5 258.