吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、松脂酸銅復配對杧果蒂腐病菌的毒力增效

葉火春　馮崗　楊佳何　王瑤　閆超　張靜

摘 要 為延緩吡唑醚菌酯抗藥性發展及科學防治杧果蒂腐病，探索吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、松脂酸銅對杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）毒力增效的最佳配方，采用菌絲生長速率法測定吡唑醚菌酯、嘧菌環胺及松脂酸銅對杧果蒂腐病菌的室內毒力，并在此基礎上，采用Horsfall法定性篩選復配藥劑的增效比例，以孫云沛共毒系數法測定聯合毒力并確定最佳復配比例。結果表明：吡唑醚菌酯與嘧菌環胺增效配比體積為7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9，其中以6∶4增效作用最顯著，CTC值達880.96；吡唑醚菌酯與松脂酸銅按Horsfall法設計9種配比均無拮抗作用，除配比8∶2為相加作用外，其他配比均表現為不同程度的增效作用，其中以3∶7增效毒性比率最大，CTC值為430.30，增效顯著。吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、松脂酸銅2種殺菌劑復配對杧果蒂腐病菌最佳毒力增效配比體積分別為6∶4和3∶7。

關鍵詞 吡唑醚菌酯 ；嘧菌環胺 ；松脂酸銅 ；可可球二孢菌 ；聯合毒力

中圖分類號 S482.2+99 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.009

Abstract Pyraclostrobin was mixed with cyprodinil or copper abietate to prepare a mixed fungicide against mango stem end rot caused by Botryodiplodia theobroma to reduce the tolerance of pyraclostrobin against the disease. The toxicity of the mixed fungicides to B. theobroma Pat was determined by using mycelium growth rate test. Horsfall design method and Sun-Johnson method were used to evaluate the synergistic effect of the fungicides against B. theobroma Pat and to screen the mixed fungicides with higher synergistic interaction. The result showed that the mixtures of pyraclostrobin and cyprodinil had synergistic effect at the ratio of 7∶3， 6∶4， 5∶5， 3∶7， 2∶8 and 1∶9， of which the mixture at the ratio of 6∶4 had the best synergistic effect with co-toxicity coefficient （CTC） being 880.96. The results of the Horsfall method showed that the mixtures of pyraclostrobin and copper abietateon exhibited no antagonistic effect but synergistic interaction except the mixture at the ratio of 8∶2 which showed additive effect. Among these mixed fungicides， the fungicide mixed at the ratio of 3∶7 had the CTC value of 430.30 and showed significant synergistic interaction in controlling the disease. Therefore， the optimal synergistic proportions of the mixtures of pyraclostrobin with cyprodinil or copper abietateon against B. theobroma Pat were 6∶4 or 3∶7.

Keywords Pyraclostrobin ； Cyprodinil ； Copper abietate； Botryodiplodia theobroma ； Co-toxicity

由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat）引起的杧果蒂腐病是一種嚴重威脅杧果貯藏期果品的重要病害[1]。該病害具有潛伏侵染的特性，在果實成熟期才呈現發病癥狀，使其防治困難[2]。近年來，吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）作為防治芒果蒂腐病害推薦用藥之一，良好的防效使得該藥的使用次數和使用量不斷增加。然而，吡唑醚菌酯屬于呼吸抑制劑，作用靶標單一，被殺菌抗性行動委員會歸類為具有高抗藥風險的藥劑[3]。嘧菌環胺是（Cyprodinil）新一代嘧啶胺類內吸性殺菌劑，主要作用機理為抑制真菌水解酶分泌和蛋氨酸的生物合成，與三唑類、嗎啉類、甲氧基丙烯酸酯類等多類已知殺菌劑無交互性抗性[4]。松脂酸銅（Copper abietate）是一種廣譜保護性有機銅殺菌劑，主要以釋放銅離子抑制病原菌的蛋白質合成及酶活性，屬于多作用位點殺菌劑，尚無抗藥性產生[5]。殺菌劑的合理復配既可有效延緩抗藥性產生，還可提高防效，擴大防治譜，降低成本[6]。為此，本實驗開展吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、松脂酸銅復配對杧果蒂腐病菌的聯合毒力研究，旨在尋找吡唑醚菌酯2種混劑的最佳增效配比，為防治杧果蒂腐病新型混劑的研發提供理論依據，并將有利于延長吡唑醚菌酯、嘧菌環胺等內吸性殺菌劑的使用壽命，提高松脂酸銅對病害的防效。

吡唑醚菌酯是巴斯夫公司開發的一種高效、廣譜、低毒的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，具有保護、治療和葉片滲透傳導作用，并對作物具有保健增產作用[7]。然而，吡唑醚菌酯作用位點單一，抗藥風險性高。Avenot等[8]從加利福尼亞州地區曾經使用過吡唑醚菌酯的開心果果園中，分離獲得59株開心果晚疫病菌發現，其中56株對吡唑醚菌酯表現出抗藥性，EC50值在53 μg/mL以上。同樣，Fernández-Ortuno等[9]，發現分離于南北卡羅來納州草莓上的218株草莓灰霉病菌對吡唑醚菌酯抗藥性菌株達到了66.7%。目前，與其他不同作用機理的殺菌劑復配成為國內外對吡唑醚菌酯研發的重點，巴斯夫公司近年先后推出多款吡唑醚菌酯復配產品，與其配伍的殺菌劑主要包括，氟環唑、代森聯、啶酰菌胺、滅菌丹、烯酰嗎啉、丁苯嗎啉、氟環唑+醚菌酯等[7]。吉沐祥等[10]開展了吡唑醚菌酯與枯草芽孢桿菌對草莓枯萎病的增效配方篩選及混劑使用技術研究，結果顯示，20%吡唑醚菌酯與200億cfu/g枯草芽孢桿菌以1∶1配比增效作用最高，推薦灌根濃度為1 000～2 000倍液。趙建江等[11]明確了吡唑醚菌酯與啶酰菌胺混配對灰葡萄孢以質量比為1∶2時，增效最明顯，在240～300 g a.i./hm2對番茄灰霉病具有良好的防治效果。陳娟芳等[12]篩選出吡唑醚菌酯與甲基硫菌靈以質量比為1∶8時，對辣椒炭疽病菌的菌絲生長和孢子萌發均有增效作用。

當前，防控杧果蒂腐病危害仍主要依賴于化學防治，常規用藥如多菌靈、烯唑醇和嘧菌酯等高效、靶標單一的殺菌劑。由于長期重復使用，致使該病原菌已對其產生不同程度的抗藥性[13]，尤其以苯并咪唑類殺菌劑更為突出。為了持續、有效地防控該病害發生及危害，采用殺菌劑間復配或者輪用的措施很有必要，實施前提則是豐富防治該病害藥劑庫[14]。胡美嬌和師超等[2，15]在對該病防治藥劑篩選中，均推薦吡唑醚菌酯作為防治該病害首選藥劑之一。臺灣馬米果嫁接苗梢枯病是同杧果蒂腐病原菌Botryodiplodia theobromae Pat（=Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Griff. & Maubl）引起的，Tovar-Pedraza等[16]對該病害藥劑篩選研究中發現，12種殺菌劑中以咯菌腈與嘧菌環胺混劑62.5%賽普護汰寧的毒力最高， EC50為0.004 3 μg/mL，吡唑醚菌酯與啶酰菌胺混劑次之，平均EC50為0.014 μg/mL。同樣，62.5%賽普護汰寧對由該種病原菌引起的木瓜蒂腐病亦具有較強的抑菌效果[17]。目前，鮮有吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、吡唑醚菌酯與松脂酸銅2種復配制劑及其對杧果蒂腐病菌聯合毒力的研究報道。為此本研究開展篩選吡唑醚菌酯與嘧菌環胺、吡唑醚菌酯與松脂酸2種復配的增效比例，確定增效較高的組合，測定這些組合對杧果蒂腐病菌的聯合毒力，最終確定吡唑醚菌酯2種混劑的最佳復配比例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat）由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所采后病理及保鮮實驗室提供，斜面低溫保存，轉接至平板培養2 d備用。

1.1.2 藥劑

98%吡唑醚菌酯原藥，購自山東濰坊雙星農藥有限公司；98%嘧菌環胺原藥，購自瑞士先正達作物保護有限公司。上述2種藥劑分別用丙酮配制為1.00×104 μg/mL母液，備用。23%松脂酸銅乳油，由山東禾宜生物科技有限公司提供。

1.1.3 培養基

PSA培養基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 殺菌劑單劑室內毒力測定

采用菌絲生長速率法[18]。在預試的基礎上，將吡唑醚菌酯和嘧菌環胺母液用0.1%吐溫-80無菌水2倍梯度稀釋，在含藥PSA平板中濃度設置為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL，而松脂酸銅乳油則用無菌水配制成2 000、1 000、500、250、125 μg/mL的含藥PSA平板。在活化2 d的杧果蒂腐病菌菌落邊緣制取直徑為4.0 mm的菌塊，轉接于含藥平板中，各處理重復3次，以不加藥劑的平板為對照，于28℃培養48 h，采用十字交叉法測量菌落直徑，按照下列公式計算菌絲抑制率，并采用EXCEL數據處理，通過抑制率的機率值和藥劑濃度對數之間的線性回歸分析，求得藥劑的EC50和EC90值。

1.2.2 復配殺菌劑增效比例篩選

根據Horsfall[19]法設計復配比例，生物測定同1.2.1。將吡唑醚菌酯與嘧菌環胺2種單劑分別以0.1%吐溫-80無菌水溶液配制劑量濃度與其EC50相同或相近的藥液，藥液以體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 、9∶1、0∶10等11種比例復配處理供試菌，以不加藥劑的處理為對照，重復3次；吡唑醚菌酯與松脂酸銅復配方法同上，并計算各復配藥劑的抑制率及毒性比率TR（實際抑制率/理論抑制率）。當TR值大于1為增效作用；等于1為相加作用；若小于1為拮抗作用。

1.2.3 復配藥劑共毒系數測定

復配藥劑選取毒性比率較高的3個配比藥劑，設置5個濃度梯度，重復3次，以不加藥劑為空白對照，生物活性測定同1.2.1，計算復配藥劑的EC50。根據上述測定結果，采用孫云沛法計算復配藥劑共毒系數（CTC），以CTC值大小評價復配藥劑的增效作用，并確定最佳藥劑復配配比。評價標準[20]：CTC≥200，為顯著增效作用；120≤CTC<200，為略微增效作用；80

式中，A、B藥劑為復配的單劑；A%和B%分別為A、B單劑在混合藥劑中的含量；標準藥劑以其中一種單劑進行計算。

2 結果與分析

2.1 3種殺菌劑對杧果蒂腐病菌室內毒力

結果顯示：吡唑醚菌酯和嘧菌環胺2種單劑對杧果蒂腐病菌菌絲生長均具有良好的抑制活性，其EC50值分別為2.59和6.37 μg/mL；而松脂酸銅對其抑菌效果較差，其EC50值為565.67 μg/mL；吡唑醚菌酯和嘧菌環胺抑菌活性明顯高于松脂酸銅，如表1所示。

2.2 復配殺菌劑毒性比率測定結果

基于各單劑EC50值，吡唑醚菌酯、嘧菌環胺和松脂酸銅分別配制成2.60、6.50和500.00 μg/mL等3種單劑藥液。經Horsfall法篩選結果表明，吡唑醚菌酯與嘧菌環胺復配以體積比為4∶6時，呈現相加作用，而以配比為7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9時，TR值均大于1，表現為增效作用，其中6∶4毒性比率最高，其次為2∶8和7∶3，如圖1所示。吡唑醚菌酯與松脂酸銅組合除配比8∶2表現為相加作用外，其他配比均有不同程度的增效作用，其中以配比3∶7增效最明顯，其次為4∶6和1∶9，如圖2所示。

2.3 復配殺菌劑的聯合毒力

如表2所示，吡唑醚菌酯與嘧菌環胺以7∶3、6∶4和2∶8三種配比復配時，以6∶4共毒系數最高，CTC達到880.96，增效顯著，其對杧果蒂腐病菌毒力最強，EC50為0.47 μg/mL，而以7∶3配比復配時， CTC值為138.29，介于120與200，表現為略微增效；吡唑醚菌酯與松脂酸銅按1∶9、3∶7和4∶6三種配比復配時，共毒系數均大于200，表現為顯著增效作用，增效順序為3∶7>4∶6>1∶9，結果驗證了Horsfall法篩選結果。這說明，松脂酸銅藥劑添加少量吡唑嘧菌酯，可明顯提高抑菌毒力。

3 結論與討論

3.1 結論

吡唑醚菌酯與嘧菌環胺對杧果蒂腐病菌室內毒力最佳增效配比為6∶4，聯合毒力優于2種單劑。吡唑醚菌酯與松脂酸銅復配對杧果蒂腐病菌毒力主要表現為增效作用，增效最顯著的配比為3∶7，少量吡唑醚菌酯可明顯提高松脂酸銅對杧果蒂腐病菌抑菌活性。

3.2 討論

保護性殺菌劑能夠阻止病菌的侵入，減輕病害的傳播流行，但是對已侵入植物體內為害的病害，防治效果甚微，內吸性殺菌劑雖然能較好地控制病害流行為害，但病原菌對其抗藥性問題不容忽視[21]。殺菌劑復配既可提高防效，減少成本，也可拓寬殺菌譜，延緩抗性，是解決上述問題的重要有效途徑。

目前，大多數吡唑醚菌酯混劑研究是利用與其他作用位點不同的殺菌劑混合增強了藥劑對病原菌生長干擾性而呈現增效作用。吡唑醚菌酯與苯醚甲環唑混合使用呈現不同程度增效作用，質量比為1∶2混劑對馬鈴薯早疫病菌毒力增效、防效顯著高于單劑防效，同時提高馬鈴薯產量，并對祁山藥炭疽病菌同樣具有增效作用[22-23]。王凱則選擇了氰霜唑與吡唑醚菌酯復配，篩選出二者以4∶1復配對馬鈴薯晚疫病菌增效最顯著[24]。本實驗篩選了吡唑醚菌酯與嘧菌環胺復配增效比例，以6∶4復配時對杧果蒂腐病菌增效作用最高。

內吸治療性殺菌劑與保護性殺菌劑合理復配，二者相得益彰，既延緩作用位點單一的內吸性殺菌抗藥性，又提高了保護性殺菌防治效果。目前這一類混劑在我國登記的復配殺菌劑中較為常見，如60%吡唑·代森聯WDG、50%唑醚·丙森鋅WDG、18%咪鮮·松脂銅EC、75%多·錳鋅WP、64%苯甲·錳鋅WP等等。本研究中，吡唑醚菌酯與松脂酸銅復配增效作用明顯，二者以3∶7復配時，增效最顯著。結果顯示，加入少量吡唑醚菌酯可提高松脂酸銅毒力作用，這種現象類似與小檗堿加入微量多菌靈即可增強其對桃褐腐病的抑制活性，其原因還有待進一步探究。本研究只在室內篩選藥劑增效復配組合，其田間防治效果是否與室內毒力一致，對作物安全性以及增效作用機理等問題還有待進一步研究。

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