維生素D檢測方法的研究進展

頓中華

摘要：應用高效液相色譜法、液質聯用法、放射免疫法、酶聯免疫法、化學發光免疫法、電化學發光免疫法、全自動生化法等檢測血清25-（OH）D濃度，可根據測定結果對人體維生素D的營養狀況做出評價，因此，在方法選擇時，應根據測定靈敏度、特異性、測定費用、測定時間及實驗人員能力和實驗室條件等實際情況進行綜合考慮。為此，筆者對有關研究進展進行綜述。

關鍵詞：維生素D；鈣代謝；25.羥基維生素D；全自動生化

中圖分類號：R446.112 文獻標志碼：A 文章編號：1008—2409（2016）04—0171—06

維生素D是人體必需的營養素，其營養狀況影響著人體鈣和磷的正常代謝，與人體健康密切相關，因此，準確測量維生素D水平對于多種鈣代謝相關疾病的預防和治療有重要意義。維生素D在血液中主要以25-羥基維生素D[25-（OH）D]的形式運輸，是評價體內維生素D營養狀況最為有效的指標。高效液相色譜法、液質聯用法、放射免疫法、酶聯免疫法、化學發光免疫法、電化學發光免疫法、全自動生化法等方法均可檢測血清25-（OH）D濃度，并根據測定結果對人體維生素D的營養狀況做出評價。筆者就常用的血清25-（OH）D濃度的檢測方法和各自特點作一綜述。

1維生素D概述

維生素D是人體必需的營養素，在自然狀態下，日光照射或植物性食物是維生素D的重要來源。維生素D是類固醇衍生物，其家族最重要的成員是維生素D₂和維生素D₃。維生素D₂多含于植物性食物中，它是由植物的麥角固醇經陽光照射而合成的，維生素D₃可由人體皮膚和脂肪組織在7-脫氫膽固醇經過陽光照射合成，這兩種形式的維生素D均無生物活性，必須在體內經過兩次羥化后方能發揮生物效應。維生素D屬脂溶性維生素，來自食物中的維生素D₂與脂肪一起經小腸吸收，在膽汁協助下形成乳糜微粒，由淋巴管進入血液，與陽光照射合成的維生素D，一起轉運入肝臟。維生素D在肝臟中經干細胞微粒體中的25-羥化酶作用下，轉化為25-羥基維生素D_[25-（OH）D]，再經過腎臟中線粒體1α羥化酶系統的作用下轉變為有生物活性的1，25-羥基維生素D[1，25-（OH）₂D]。維生素D、25-（OH）D、1，25-（OH）：D在人體內的半衰期分別為24 h、2周和4h。維生素D在血液中主要以25-（OH）D的形式運輸，其濃度最高，最穩定，而且半衰期最長，能反映食物攝入和日光照射合成的維生素D總量，因此，血清25-（OH）D濃度是評價體內維生素D營養狀況最為有效的指標。通常將維生素D缺乏定義為血清25-（OH）D水平低于20ng/ml，不足為20～30ng/ml，充足為30ng/ml以上。

維持正常的維生素D水平對調節鈣磷代謝至關重要。具有生物活性的1，25-（OH）₂D可以促進腸道鈣結合蛋白的合成，通過下述3個方面使血清鈣、磷含量增高；首先，促進腸道內鈣、磷的吸收和運轉，增加在體內的留存；其次，提高腎小管對鈣、磷離子的再吸收，使尿鈣、磷排出減少；最后，當低血鈣膳食中缺鈣時，在甲狀旁腺素（PTH）的作用下促進鈣、磷的吸收，動員骨中鈣、磷釋出。在維生素D缺乏的情況下，食物中的鈣只有10%—15%能夠被吸收，磷只有60%能夠被吸收。1，25-（OH）₂d通過與維生素受體結合，可提高腸道對鈣磷的吸收效率，使鈣吸收增加至30%～40%，磷增加至80%左右。眾所周知，維生素D具有傳統意義上的骨骼效應，近年來研究顯示，維生素D不僅能夠調節鈣磷平衡和骨骼代謝，還具有調節免疫、抗腫瘤、調控細胞增殖、防治代謝綜合征、抗炎、保護心血管健康等多種生物學功能。

然而，維生素D缺乏或不足的狀況在全球范圍內普遍存在，按照國際上對維生素D狀態評價的普遍標準，全球已有50%的人口存在維生素D缺乏的風險。維生素D缺乏可能導致兒童佝僂病、新生兒低血鈣、甲狀腺功能減退、中老年人骨質疏松、骨軟化癥等多種鈣代謝異常疾病，而且可使患高血壓、冠心病的危險性增加。但長期或大劑量過多使用維生素D也會發生中毒，過量維生素D可導致高鈣血癥及多種衰老相關疾病，因此，有必要探索建立可靠、高效的測定方法，為維生素D的檢測、相關疾病的診斷和預防提供有力的科學依據。

2維生素D的檢測方法

現有多種方法用于測定血清25-（OH）D濃度來評價機體維生素D的營養狀況，根據方法原理不同，可分為色譜分析法和免疫分析法。色譜分析法包括高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），可分離并檢測不同的分析物，能區分并分別定量25-（OH）D₂和25-（OH）D₅。免疫分析法包括放射免疫法（RIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、化學發光免疫測定法（CLIA）、電化學發光免疫測定法（ECLIA）、全自動生化分析法等，由于所有的維生素D羥化物都能發生抗體抗原結合反應，因此，只能測定25-（OH）D總量，無法同時測定25-（OH）D₂和25-（OH）D₃的濃度。

2.1高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法（HPLC）是早期應用較多的色譜法之一，可以同時檢測25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，其靈敏度、特異性和準確性都較高，與LC-MS/MS法的結果一致性較好。與免疫法相比，HPLC的相對不確定度小，分析操作省時省力，具有分離效能高、分析速度快、重復性好、節約成本、精確度高、可自動化等優點。但是HPLC的不足之處是設備較貴，檢測通量小，所需樣品量大，標本前處理過程復雜，對操作人員要求較高等，目前臨床使用較少。而且，HPLC雖然能夠分開25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，但25-（OH）D₂濃度太低，HPLC檢測限達不到要求。隨著監測技術及精度的發展，FIPLC逐步被LC-MS/MS法所替代。

王劍建立HPLC法測定正常兒童血清25-（OH）D₃含量并評價其應用。樣品用甲醇沉淀蛋白，以10%二氯甲烷-正己烷提??；甲醇—水（88：12）為流動相，選用Diamonsil^Tm（250 min×4.6 mm，5μm）色譜柱進行分離，流速為1 ml/min，檢測波長為265 mm，柱溫30℃。以25-（OH）D₃標準品外標法建立標準曲線，結果發現，該方法在10～200μg/L濃度范圍內線性關系好（r=0.9971），方法回收率為93.4%～106.2%，提取回收率為88.8%～94.1%。同時也獲得了較好的精度，日內變異系數（CV）為3.5%～4.4%，日間CV為3.9%～4.7%，最小檢測范圍為5 μg/L。劉怡欣利用HPLC法測定健康成年人血清25-（OH）D₃含量，建立方法學與上一研究類似，結果發現，25-（OH）D，在線性范圍8～160μg/L內與其響應值線性關系良好（r=0.9999），平均回收率為92.5%～109.5%，日內精密度（RSD）為2.0%～4.6%，日間RSD為2.9%～5.2%，最小檢測范圍為4μg/L。此方法檢測25-（0H）D具有較高的回收率、較好的精密度和準確性，可用于臨床實驗室開展血清25-（OH）D含量測定。

2.2液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）

液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）是色譜法中最為常用的25-（OH）D檢測方法，樣品經處理后采用液相色譜分離，檢測器為串聯質譜儀，在多反應監測掃描模式下，實現分子離子和碎片離子2次質量選擇，可同時檢測25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，具有非常高的靈敏度、特異性和準確性，被國際公認為檢測的金標準。雖然LC-MS/MS在25-（OH）D檢測特異性具有明顯的優勢，但需要樣品量較大，樣品前處理復雜耗時長，儀器操作較復雜，對操作人員的要求較高，儀器昂貴，而且需要自己開發方法等，一定程度上限制了LC-MS/MS的臨床推廣使用。

Tai等采用液-液萃取反相LC-MS/MS法檢測已知濃度的25-（OH）D標本，考察和評價方法學。結果顯示，25-（OH）D₂和25-（OH）D₃的回收率為99.0%～101.0%，絕對回收率分別為92%和97%。而且，研究顯示方法的精度非常高，當25-（OH）D>1ng/g時的CV為0.2%～0.6%；25-（OH）D<1 ng/g時的CV<2%。該方法能夠將25-（OH）D₂和25-（OH）D3與其各自的同分異構體分離開。在信噪比約為3時，檢測限約為0.15 ng/g。曾義建立LC-MS/MS法測定血清中的25-（0H）D含量，結果顯示，25-（OH）D₂和25-（OH）D₃在5～100 ng/ml的質量濃度線性范圍與峰面積有良好的線性關系（r²=0.9992，0.9995），回收率在96.19%～108.23%，日內RSD為1.29%～3.71%，日間RSD為4.03%～7.10%，檢測限為2 sg/ml。徐鳳仙建立LC-MS/MS法測定健康志愿者血清25-（OH）D含量，結果表明，LC-MS/MS法檢測血清25-（OH）D：和25-（OH）D，在0.5～10.0 ng/ml、5～100ng/ml范圍內線性良好（r²=0.9991，0.9999），批內RSD為0.88%～7.69%，批間RSD為1.56%～9.90%，校準品測試結果正確度為95.5%～101.2%，因此，應用LC-MS/MS檢測血清25-（OH）D₂和25-（OH）D，具有良好的準確度和精密度，適合在臨床推廣使用，同時可以作為標準與其他檢測25-（OH）D的方法作比較。

2.3放射免疫法（RIA）

放射免疫法（RIA）是最為經典的測定血清25-（OH）D的方法。目前應用較廣泛的試劑盒采用¹²⁵I-25-（OH）D₃作為示蹤物，與待測樣品中25-（OH）D競爭性結合抗25-（OH）D山羊抗體，用兩步抗原抗體反應以實現固液分離，并用Gamma計數器檢測沉淀中¹²⁵I的放射量以計算樣品中25-（OH）D的濃度。該方法不需要復雜的樣品預處理純化過程，操作簡單，解決了HPLC法操作復雜不適于臨床檢測應用的問題。RIA試劑盒目前應用比較廣泛、方便，靈敏度高，特異性強，精密度好，所需要的儀器要求較低，是基層單位對超微量物質測定的主要手段。但是RIA法不能區分檢測25-（OH）D₂和25-（OH）D₃，還具有放射性污染的潛在風險，對實驗人員和環境都有損害，放射性廢物的處理也比較復雜。而且測量需要設立平行樣，花費較多，每次檢測的數量有限。

多項研究報道，對于血清25-（OH）D的測定，RIA法與LC-MS/MS法測定結果的相關性較好。Van denOuweland等比較了Diasorin RIA法與LC-MS/MS法檢測來自國際維生素D室間質評計劃（DEQAS）的室間質控標本，同時也分析比較了其他使用LC-MS/MS方法的實驗室檢測結果，結果發現，RIA法與LC-MS/MS法結果符合度高，相關系數，r²=0.90，平均偏差為1.61nmol/L。Farrell等對170例隨機選取的患者標本分別采用RIA法和LC-MS/MS法檢測，連續5 d取2份血清重復測量5次，以評估批內及批外的精密度，結果顯示，LC-MS/MS法的一致相關性（CCC）為0.99，平均偏差為1.4 nmol/L，RIA法與LC-MS/MS，法相當，其CCC為0.97，平均偏差為2.7 nmol/L。鄭曉艷對53例血清樣本分別采用RIA法和LC-MS/MS法檢測25-（0H）D，結果顯示兩者相關性良好，相關系數，為0.883。RIA法與金標準LC-MS/MS法檢測的相關性好，使用方便，適合于常規臨床實驗室開展。

2.4酶聯免疫吸附法（ELISA）

酶聯免疫口及附法（ELISA）是早期維生素D測定的主流方法，是將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法：ELISA法在自動化操作、節省人力、無污染等方面具有一定的優勢，適合于常規臨床實驗室開展.但是該法只能用于檢測25-（OH）D總的含量，當受試者服用維生素D₂時，ELISA法測定會存在偏差，可能造成臨床決策的失誤，使維生素D中毒風險增大

另外，ELISA法的主要缺陷是對基質敏感，容易與其他非目標化合物發生交叉反應，導致方法特異性不足。而且，酶促反應受反應溫度、時間、加樣準確性、洗板等因素影響.批內和批間的變異系數相對較大

高玲娟采用ELISA試劑盒檢測25-（OH）D水平，對ELISA方法學進行系統評價，結果發現，ELISA測定25-（OH）D的批內CV為2.13%～4.32%，批間CV<5%，定值質控品相對偏差≤8%，擬合曲線相關系數R²≥0.99，最低檢出限為5 nmol/L，符合臨床使用的要求。毛旭東隨機選取50例患者，對同一血清樣本分別用ELISA法和LC-MS/MS法測定25-（OH）D₃水平，結果顯示，LC-MS/MS法測定的25-（OH）D₃均數為（14.99+6.51）ng/ml，EI=ISA法測定的均數為（20.91±9.70）ng/ml，兩者的相關系數為0.725，LC-MS/MS法組25-（OH）D₃濃度高于20 ng/ml的為17%，ELISA法組為52%。LC-MS/MS法測定的25-（OH）D₃數值明顯低于ELISA法，兩者正相關性較高，可經方程互換，ELISA法低估了體內維生素D的缺乏一盡管ELISA法的缺點較為顯著，但在嚴格控制實驗條件下，作為大規模篩查維生素D缺乏及過量的方法，ELISA法具有其他方法不可比擬的優勢，目前仍廣泛用于臨床的體外診斷。

2.5化學發光免疫測定法（CLIA）

化學發光免疫測定試劑盒使用連接有異魯米諾衍生物的25-（OH）D與樣品中25-（OH）D競爭性結合包被了25-（OH）D特異性抗體的磁珠，反應終止后加入激發劑，使用光電倍增管檢測產生的化學熒光信號。CLIA法的優點是操作簡單、快速，無同位素污染，而且容易自動化，現已有多家廠商開發出相關自動免疫分析儀；缺點是儀器價格高、只能用于檢測25-（0H）D總的含量。

單詠梅對LIAISON全自動化學發光儀測定25-（OH）D的檢測性能進行驗證和評估，實驗結果表明線性范圍為6～131 ng/ml，批內RSD為5.23%，批間RSD為1.06%，總RSD為6.57%，分析靈敏度為2.5 ng/ml，功能靈敏度為3.0 ng/ml，可以滿足臨床使用需要，Frenzel等。對比了LIAISON CLIA法與Dia RIA法和LC-MS/MS測定25-（0H）D的結果相關性，CLIA法測定的結果與RIA檢測結果的相關系數為0.94，與LC-MS/MS的相關系數為0.95。CLIA測定結果準確性和特異性高，自動化、可控性強，適合大規模維生素D營養狀況監測。

2.6電化學發光免疫測定法（ECLIA）

電化學發光免疫測定試劑盒使用生物素標記的25-（OH）D與樣品中25-（0H）D競爭性結合釘標記的維生素D結合蛋白（DBP）后，用包被r鏈霉親和素的磁珠將生物素標記的25-（0H）D-釕標記的維生素D結合蛋白復合體固定，光電倍增管檢測釘的電發光信號強度回算樣品中的25-（OH）D濃度。該法具有高靈敏度，且所受影響因素較少，能自動化批量操作÷

何國堅應用羅氏CS E170分析儀采用ECLIA法檢測維生素D，結果顯示，其線性范圍為3～70 ng/ml（r=0.9881，檢出限為3.0 ng/ml；2種不同濃度的定值質控血清在準確度評估中相對偏差均<8%；3種不同濃度的臨床患者混合血清及2種不同濃度的定值質控血清評估精密度批內、批問CV均<5%，符合臨床檢測的要求。有學者分析比較了羅氏E170電化學發光免疫分析儀與RIA、HPLC、LC-MS/MS檢測25-（OH）D₃結果的符合性，發現ECLIA法與RIA和LC-MS/MS檢測結果的一致性較好。所以，ECLIA法檢測維生素D的準確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力等均符合臨床檢驗要求。

2.7全自動生化分析法

全自動生化分析法利用全自動生化儀，根據光電比色原理來測量血液中25-（OH）D的總含量。由于其操作簡單、測量速度快、準確性較高、消耗試劑量小，在各級醫院得到廣泛應用。其缺點是僅能檢測25-（OH）D的總含量，精密度和特異性稍差，儀器間的性能差異大，容易造成樣品間交叉污染。

目前利用全自動生化法檢測維生素D的相關報道較少。宋愛華評估了全自動生化法測定25-（OH）D的方法學，結果顯示，該方法的回收率為108%；其空白限為3.5 ng/ml，定量檢出限為7.6 ng/ml，檢測線性上限可達148 ng/ml；其批內、日間及總CV小于10%，對于病理異常低值樣本，其批內、日間及總CV小于15%：而且，與索林CLIA法測定結果的相關系數r=0.9941，因此，全自動生化分析法分析性能良好，操作簡便，適合各級醫院推廣應用。

綜上所述，維生素D是兒童生長發育過程中不可缺少的營養物質之一，成人在維持機體代謝和預防疾病方面也不可缺少。測定血清中25-（OH）D的含量是評價人體維生素D營養狀況的最佳指標，臨床上對25-（OH）D的檢測需求越來越大。目前臨床常用的方法有免疫分析法和色譜法。各種測定方法都有其優缺點，原理和操作步驟也有所不同，不同方法之間的25-（OH）D檢測結果可能出現不同程度的差異，因此，在方法選擇時，應根據測定靈敏度、特異性、測定費用、測定時間及實驗人員能力和實驗室條件等實際情況進行綜合考慮。