超濾法結合HPLC法測定白藜蘆醇的血漿蛋白結合率

鮑慧瑋　侯曉琳　劉芳馨　劉佳　李麗靜

【摘 要】 目的：建立測定白藜蘆醇與大鼠、小鼠、家兔血漿蛋白結合率的方法，并測定其結果，為白藜蘆醇的藥代動力學及臨床用藥提供參考。方法：采用超濾法結合HPLC法對白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿的蛋白結合率進行測定。結果：白藜蘆醇在0521～2297μg的線性關系良好，標準曲線為Y=11434X-00409（r=09995）。白藜蘆醇與大鼠血漿、小鼠血漿和家兔在0504μg/mL、504μg/mL、2016μg/mL的含藥血漿中的蛋白結合率為（9032±009）%、（8932±004）%、（9152±012）%。結論：該方法重復性和專屬性好，操作簡單、快捷，能夠滿足樣品定量分析測定要求；測定結果表明，白藜蘆醇與血漿蛋白有很強的結合，且在考察范圍內蛋白結合率對血藥濃度無明顯的依賴性。

【關鍵詞】 白藜蘆醇；超濾法；HPLC；血漿蛋白結合率

【中圖分類號】R2841 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）20-0023-04

白藜蘆醇（trans-3，5，4-o-trihydroxystilbene）是存在于虎杖、花生、桑椹、葡萄等植物中的一種生物活性極強的多酚類物質，具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]和抗炎[3]等多方面作用，且在抑制血小板聚集、預防腹部、心臟病、關節等外科手術后纖維組織粘連和舒張血管方面也具有良好的藥理活性[4-6]。近年來其頗受關注和研究，是一種潛在開發的藥物。但其在藥代動力學方面研究較少，尤其在血漿蛋白結合率方面并無研究。而藥物的血漿蛋白結合率是藥代動力學中重要參數，與藥物在體內的吸收、代謝、分布和排泄等密切相關[7-8]，對今后其新藥的研發和臨床應用具有重要的意義[9-11]。實驗采用超濾法和HPLC結合的方法[12-15]對白藜蘆醇和大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白結合率進行研究，為對白藜蘆醇藥代動力學的研究提供參考。

1 儀器與材料

11 儀器 Agilent1260型高效液相（含DAD檢測器，美國Agilent有限公司）；WP-UP-III-10沃特浦實驗室用超純水器（四川沃特爾科技發展有限公司）；超濾管（醋酸纖維素膜，相對分子質量截留值10kD，Millopore公司）；TG1650-WS 型高速離心機（上海盧湘儀）；SK-1快速混勻器（江蘇金壇市江南儀器制造廠）；AVW20D型電子天平（日本島津制作所）。

12 試藥 白藜蘆醇（批號：111535-200502，中國藥品生物制品鑒定所）；甲醇（色譜純，美國FISHER公司）；超純水（自制）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀等均為分析純。

13 動物 SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供（合格證號：SCXK（吉）2011-0004），毛細管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。SD小鼠，雄性，體重（200±20）g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供（合格證號：SCXK（吉）2011-0004），毛細管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。實驗兔，雄性，體重18～22kg，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供（合格證號：SCXK（吉）2012-0002），毛細管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。

2 方法與結果

21 色譜條件 Venusil MP-C18（250mm×46mm，5μm）色譜柱，流動相為甲醇-水（V∶V=45∶55），流速1mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為290nm，進樣量為10μL，理論塔板數按照白藜蘆醇計算不低于2000，且與其他物質分離度良好，符合藥典規定。

22 溶液配制

221 等滲PBS溶液的配制 分別稱取磷酸二氫鉀259g，磷酸氫二鉀1411g，氯化鈉199g，磷酸氫二鉀1411g，置于1000mL容量瓶中，加入適量超純水，超聲溶解，超純水定容至刻度，搖勻，即為等滲PBS溶液。

222 對照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇對照品約5mg，置1L容量瓶中，加入適量等滲PBS，均勻混合，定容至刻度，搖勻，即得濃度約為5μg/mL的白藜蘆醇儲備液。

223 供試品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇標準品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取025、25、100mL加入25mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得濃度為504、504、2016μg/mL的PBS溶液。分別精密吸取50μL，置于450μL空白大鼠、小鼠、家兔血樣中，均勻混合，得到濃度為0504、504、2016μg/mL的高、中、低濃度的血漿樣品。分別置于37℃水浴鍋中溫預3h后，將溫預后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到各血漿超濾液，即得高、中、低濃度的供試品，在4℃下保存。

23 專屬性考察 取空白大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿各400μL，分別置于37℃水浴鍋中溫預3h后，將溫預后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。分別將白藜蘆醇對照品、空白血漿超濾液和供試品溶液按照“21”項下色譜條件進入高效液相，白藜蘆醇對照品峰形良好，且與其它峰分離度良好，具有良好的專屬性，見圖2、3、4。

24 線性關系考察 精密稱取白藜蘆醇標準品252mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取01、02、10、20、40、50mL加入100mL容量瓶中，

定容至刻度，搖勻，得濃度為0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”項下色譜條件方法進入高效液相色譜中，記錄峰面積，以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，計算回歸方程為Y=11434X-00409（r=09995），線性范圍為0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，連續進樣6d，計算日內精密度的RSD值，連續進樣6d，計算日間精密度RSD，結果見表1。

252 超濾液精密度考察 取“223”項下供試品溶液，連續進樣6次，計算日內精密度的RSD值，連續進樣6d，計算日間精密度RSD，結果見表1。

26 穩定性考察

261 PBS溶液穩定性考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計算RSD值，結果見表1。

262 超濾液穩定性考察 取“223”項下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計算RSD值。

27 超濾液回收率的考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，吸取超濾液，按照“21”項下色譜條件進入高效液相色譜儀，與相應對照品溶液峰面積對比計算回收率。結果超濾膜回收率均≥95%，證明超濾膜對白藜蘆醇無特異性吸附。

28 血漿蛋白結合率實驗 取“252”項下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3個濃度的大鼠、小鼠、家兔樣品，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。按照“21”項下色譜條件進入高效液相，計算其血漿蛋白結合率。

蛋白結合率=ρ超濾前-ρ超濾后ρ超濾前×100%

式中：ρ超濾前為超濾前溶液中白藜蘆醇的質量濃度，μg/L；ρ超濾后為超濾液中白藜蘆醇的質量濃度，μg/L。

數據經SPSS 130軟件進行方差分析，結果表明低、中、高3種濃度的供試品溶液與大鼠、小鼠和家兔的血漿蛋白結合率無統計學差異。

3 討論

31 波長的選擇 通過DAD檢測器，在各波長下，對不同色譜條件超濾液和對照品進行分析。最終確定在波長為290nm時，樣品分離效果最好，與其它雜質的分離度均符合藥典藥典規定。

32 測定方法的選擇 據文獻報道[16]，有多種血漿蛋白結合率測定的方法，常用的有超濾法、平衡透析法、凝膠過濾法、白蛋白微球測定法、超速離心法等。實驗采用超濾法，其是一種經典的測定方法，具有樣品測定準確、速率高、成本低等顯著優勢，適用于大量樣品的測定。超濾法減少了非特異性的表面吸附，縮短了平衡時間，加快了待測樣品的測定時間，且不受稀釋效應和體積遷移的影響。

33 超濾管的選擇 實驗選用截留向相對分子質量為10K的超濾管，可以將超濾管內的血漿蛋白、內源性物質及其他成分在透析的過程中穩定的保存于超濾管濾膜內，不對樣品進行干擾，可以很好的測定白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿蛋白的結合率。

34 樣品的選擇和意義 白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多方面性質等方面都有良好的藥理作用，是一種很有潛力的藥品[10-11]，但對于其血漿蛋白結合率并沒有研究。白藜蘆醇藥物被吸收后部分呈游離的分子狀態，這部分游離的藥物分子能從血液中進入作用部位，并發揮藥理作用，與血漿蛋白結合的藥物卻沒有藥理活性。當游離的白藜蘆醇被代謝或者進入組織后，部分與血漿蛋白結合的白藜蘆醇又可以分開并彌補游離的藥物。藥物的這種可逆性結合可以影響白藜蘆醇的藥代動力學、作用時間、作用強度都密切相關，且與其作用機制、藥物相互作用等密切相關，故本試驗對白藜蘆醇的血漿蛋白結合率的研究具有重要意義。

研究結果顯示，白藜蘆醇具有高蛋白結合率，可使其在體內的表觀分布容積相對較大，半衰期增長，腎清除速率減慢；通過對大鼠、小鼠和家兔的超濾液色譜圖對比，結果發現它們色譜圖基本相同，可能因為血漿蛋白其成分相似。此方法適用于大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白蛋白結合率的測定，其對藥代動力學和臨床應用也有極大的意義。

參考文獻

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.

定容至刻度，搖勻，得濃度為0504、1008、504、1008、2016、252μg/mL的PBS溶液。按照“21”項下色譜條件方法進入高效液相色譜中，記錄峰面積，以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，計算回歸方程為Y=11434X-00409（r=09995），線性范圍為0504～252μg。

25 精密度考察

251 PBS液精密度考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，連續進樣6d，計算日內精密度的RSD值，連續進樣6d，計算日間精密度RSD，結果見表1。

252 超濾液精密度考察 取“223”項下供試品溶液，連續進樣6次，計算日內精密度的RSD值，連續進樣6d，計算日間精密度RSD，結果見表1。

26 穩定性考察

261 PBS溶液穩定性考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計算RSD值，結果見表1。

262 超濾液穩定性考察 取“223”項下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計算RSD值。

27 超濾液回收率的考察 取“24 線性關系考察”中濃度為0504、504、2016μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對照品溶液，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，吸取超濾液，按照“21”項下色譜條件進入高效液相色譜儀，與相應對照品溶液峰面積對比計算回收率。結果超濾膜回收率均≥95%，證明超濾膜對白藜蘆醇無特異性吸附。

28 血漿蛋白結合率實驗 取“252”項下中0504、504、2016μg/mL的低、中、高3個濃度的大鼠、小鼠、家兔樣品，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。按照“21”項下色譜條件進入高效液相，計算其血漿蛋白結合率。

蛋白結合率=ρ超濾前-ρ超濾后ρ超濾前×100%

式中：ρ超濾前為超濾前溶液中白藜蘆醇的質量濃度，μg/L；ρ超濾后為超濾液中白藜蘆醇的質量濃度，μg/L。

數據經SPSS 130軟件進行方差分析，結果表明低、中、高3種濃度的供試品溶液與大鼠、小鼠和家兔的血漿蛋白結合率無統計學差異。

3 討論

31 波長的選擇 通過DAD檢測器，在各波長下，對不同色譜條件超濾液和對照品進行分析。最終確定在波長為290nm時，樣品分離效果最好，與其它雜質的分離度均符合藥典藥典規定。

32 測定方法的選擇 據文獻報道[16]，有多種血漿蛋白結合率測定的方法，常用的有超濾法、平衡透析法、凝膠過濾法、白蛋白微球測定法、超速離心法等。實驗采用超濾法，其是一種經典的測定方法，具有樣品測定準確、速率高、成本低等顯著優勢，適用于大量樣品的測定。超濾法減少了非特異性的表面吸附，縮短了平衡時間，加快了待測樣品的測定時間，且不受稀釋效應和體積遷移的影響。

33 超濾管的選擇 實驗選用截留向相對分子質量為10K的超濾管，可以將超濾管內的血漿蛋白、內源性物質及其他成分在透析的過程中穩定的保存于超濾管濾膜內，不對樣品進行干擾，可以很好的測定白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿蛋白的結合率。

34 樣品的選擇和意義 白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多方面性質等方面都有良好的藥理作用，是一種很有潛力的藥品[10-11]，但對于其血漿蛋白結合率并沒有研究。白藜蘆醇藥物被吸收后部分呈游離的分子狀態，這部分游離的藥物分子能從血液中進入作用部位，并發揮藥理作用，與血漿蛋白結合的藥物卻沒有藥理活性。當游離的白藜蘆醇被代謝或者進入組織后，部分與血漿蛋白結合的白藜蘆醇又可以分開并彌補游離的藥物。藥物的這種可逆性結合可以影響白藜蘆醇的藥代動力學、作用時間、作用強度都密切相關，且與其作用機制、藥物相互作用等密切相關，故本試驗對白藜蘆醇的血漿蛋白結合率的研究具有重要意義。

研究結果顯示，白藜蘆醇具有高蛋白結合率，可使其在體內的表觀分布容積相對較大，半衰期增長，腎清除速率減慢；通過對大鼠、小鼠和家兔的超濾液色譜圖對比，結果發現它們色譜圖基本相同，可能因為血漿蛋白其成分相似。此方法適用于大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白蛋白結合率的測定，其對藥代動力學和臨床應用也有極大的意義。

參考文獻

[1] Chow S E， Kao C H， Liu Y T A， et al. Resveratrol induced ER expansion and ER caspase-mediated apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Apoptosis， 2014， 19（3）： 527-541.

[2]Hangun-Balkir Y， McKenney M L. Determination of antioxidant activities of berries and resveratrol[J]. Green Chemistry Letters and Reviews， 2012， 5（2）： 147-153.

[3]Riveiro-Naveira R R， Loureiro J， Valcárcel-Ares M N， et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol as a dietary supplement in an antigen-induced arthritis rat model[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2014， 22： 290.