繼發性紅細胞增多癥對COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細胞凋亡及Bcl-2表達的影響※

齊亞麗，解友邦，顧玉海

(青海省人民醫院，青海 西寧 810007)

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繼發性紅細胞增多癥對COPD男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細胞凋亡及Bcl-2表達的影響※

齊亞麗，解友邦，顧玉海*

(青海省人民醫院，青海 西寧 810007)

目的 探討繼發性紅細胞增多癥(SP)對慢性阻塞性肺疾病(COPD)男性患者呼吸功能和骨髓有核紅細胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響。方法 分別選取30名單純骨折男性患者和32名COPD男性患者、21名COPD+SP男性患者作為對照組和COPD組、COPD+SP組。用肺功能儀等儀器評價患者呼吸功能。用流式細胞儀測定骨髓有核紅細胞凋亡率、RT-PCR 法檢測Bcl-2 mRNA 的表達水平。結果 COPD+SP組肺功能(FEV1/FVC%)低于COPD組，而mMRC呼吸困難評價分級評分大于COPD組(P<0.05)；COPD+SP組骨髓有核紅細胞凋亡率明顯低于對照組和COPD組(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達明顯高于對照組和COPD組(P<0.05)。結論 SP影響COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困難的程度。Bcl-2家族分子可能參與了COPD+SP男性患者骨髓有核紅細胞凋亡異常的機制。

慢性阻塞性肺疾病 繼續性發紅細胞增多癥 骨髓有核紅細胞 細胞凋亡 Bcl-2

目前關于慢性阻塞性肺疾病合并繼發性紅細胞增多癥的臨床研究文獻有一些報道[1-2]，但關于繼發性紅細胞增多癥(SP)影響慢性阻塞性肺疾病(COPD)骨髓紅系細胞凋亡和抗凋亡的研究未見報道。本研究探討了SP對COPD患者呼吸功能和骨髓有核紅細胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響，為臨床合理治療慢性阻塞性肺疾病合并繼發性紅細胞增多癥提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇

患者共分為對照組和COPD組、COPD+SP組。對照組為30例男性單純骨折患者，年齡36.9±16.9歲，通過入院常規檢查排除其他疾病。COPD組為32例男性患者，年齡43.3±15.4歲，結合病史嚴格按照COPD指南進行癥狀、體征、肺功能及其他相關輔助檢查。COPD+SP組為21例男性患者，年齡39.5±14.9歲，結合病史嚴格按照COPD指南和SP診斷標準進行癥狀、體征、肺功能及其他相關輔助檢查，并采用AS-PCR法檢測骨髓細胞JAK-2V617F突變情況，要求均為陰性，以排除真性紅細胞增多癥。研究經青海省人民醫院醫學倫理委員會審核通過，并取得研究對象知情同意。

1.2 呼吸功能評價

采用FEV1/FVC%、CAT(COPD assessment test，CAT)評分、mMRC(breathlessness measurement using the modified British Medical Reseach Council，mMRC)呼吸困難分級評分等評價患者呼吸功能。

1.3 血紅蛋白、紅細胞和紅細胞壓積測定

采用全自動生化分析儀測定患者血紅蛋白、紅細胞和紅細胞壓積。

1.4 有核紅細胞凋亡檢測

采用密度梯度法分離骨髓單個核細胞、免疫磁珠法分離單個核細胞中的有核紅細胞(CD71)；流式細胞儀法檢測骨髓有核紅細胞細胞凋亡。嚴格按凋亡試劑盒(美國BD公司) 說明書操作。用流式細胞儀自帶軟件分析結果。

1.5 Bcl-2 mRNA表達測定

用Trizol試劑提取總RNA并定量，取適量RNA用AMV反轉錄酶制備cDNA。用熒光定量PCR儀進行PCR反應，反應參數：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火，共40個循環。每次擴增設置β-actin基因內參照。用PCR儀自帶軟件進行熒光定量分析，得出Ct值。引物和TagMan熒光探針由Primer Express軟件設計，上海生工生物工程有限公司合成。

Bcl-2引物序列：

5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′(上游引物)

5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′(下游引物)

GAPDH引物序列：

5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′(上游引物)

5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′(下游引物)

1.6 數據統計分析

2 結果

2.1 血紅蛋白、紅細胞和紅細胞壓積

對照組和COPD組、COPD+SP組的血紅蛋白和紅細胞、紅細胞壓積測定結果見表1。表1顯示，與對照組比較，COPD+SP組的血紅蛋白和紅細胞、紅細胞壓積分別顯著升高69.93%和49.44%、23.20%。與COPD組比較，COPD+SP組的血紅蛋白、紅細胞和紅細胞壓積分別顯著升高61.07%、37.27%和11.47%。

2.2 呼吸功能評價結果

COPD組和COPD+SP組的肺功能比值(FEV1/FVC%)、CAT評分、mMRC呼吸困難評價分級評分結果見表2。表2顯示，COPD+SP組肺功能比值(FEV1/FVC%)低于COPD組，而mMRC呼吸困難評價分級評分大于COPD組。

Table 1 Comparison of the levels of Hb，RBC and HCT in Control，COPD and COPD+SP ±s)

a：與對照組比較，P<0.05；b：與COPD組比較，P<0.05.

組別例數FEV1/FVC(%)CAT評分mMRC呼吸困難分級(分)COPD組3275．36±5．643．86±1．284．52±1．26COPD+SP組2164．86±7．253．92±0．945．32±0．87

2.3 骨髓有核紅細胞凋亡率和Bcl-2 mRNA 表達水平

對照組和COPD組、COPD+SP組的骨髓有核紅細胞凋亡情況見表3和圖1，Bcl-2 mRNA表達見表3。表3、圖1顯示，COPD+SP組骨髓有核紅細胞凋亡率明顯低于對照組和COPD組(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達明顯高于對照組和COPD組。

組別例數骨髓有核紅細胞凋亡率(%)Bcl-2mRNA對照組304．62±1．205．92±1．16COPD組324．53±1．216．21±2．70COPD+SP組211．32±0．66※#10．15±2．92※#

a：與對照組比較，P<0.05；b：與COPD組比較，P<0.05.

2.4 骨髓有核紅細胞凋亡率和Bcl-2 mRNA表達量及與Hb濃度的相關性

和Bcl-2 mRNA表達量及Hb濃度的相關性分析結果見圖2。圖2顯示，Bcl-2 mRNA表達量和骨髓有核紅細胞凋亡率呈負相關，而凋亡率和血紅蛋白濃度呈負相關。

圖1 骨髓有核紅細胞凋亡指數流式圖(1：對照組；2：COPD組；3：COPD+SP組)

Figure 1 Apoptosis chart of bone marrow nucleated cells detected by flow cytometry(1：Control group；2：COPD group；3：COPD+SP group)

3 討論

本研究顯示，SP影響COPD男性患者的肺功能，加重呼吸困難的程度。Bcl-2家族分子可能參與了COPD+SP男性患者骨髓有核紅細胞凋亡異常的機制。

SP主要有真性、繼發性、相對性和應激性紅細胞增多癥。SP又分新生兒紅細胞增多癥、高原性紅細胞增多癥以及慢性肺疾病、心血管疾病等繼發性紅細胞增多癥。慢性阻塞性肺疾病繼發紅細胞增多可導致脾大、高血壓、血栓等，這些并發癥對患者造成了嚴重威脅[3]。目前關于繼發性紅細胞增多對肺功能及呼吸困難程度的影響未見報道，但有學者在臨床治療中發現燈盞花素治療AECOPD可明顯改善患者的肺功能，降低血液粘稠度，糾正高凝狀態，改善微循環，增加血氧飽和度和改善肺功能[4]，COPD是引起腦梗死的高危因素，這可能與慢性阻塞性肺病患者長期慢性缺氧，二氧化碳潴留，D-二聚體，血紅蛋白及纖維蛋白原升高有關[5]。

本研究發現COPD合并繼發性紅細胞增多癥后，肺功能降低明顯，可能與紅細胞的過度累計導致血液粘度增大，進而影響氣血交換有關。高原紅細胞增多癥患者血粘度和紅細胞壓積相比高原健康人群顯著升高，由于環境缺氧，血液中紅細胞數代償性增加，使紅細胞壓積升高，血紅蛋白增加，引起血粘度升高，使紅細胞的變形性下降，引起全血粘度升高[6]，但目前關于血液粘度對肺功能的影響國內未見報道，但很多文獻報道COPD患者通過活血化瘀或抗凝治療改善患者肺功能的同時減輕呼吸困難的程度。

慢性高原病紅細胞增多的機制研究發現，在骨髓有核紅細胞增多的基礎上伴有紅細胞凋亡的降低[7，8]，但是關于COPD合并繼發性紅細胞增多的骨髓有核紅細胞凋亡機制的研究較少。有報道稱，繼發性紅細胞增多癥患者血清P53蛋白和Bcl-2蛋白水平增加，并且均與Hb濃度呈顯著正相關，提示P53蛋白和Bcl-2蛋白可能與繼發紅細胞增多的發生發展有關[10]。

我們的研究結果證實，繼發性紅細胞增多癥患者骨髓有核紅細胞凋亡指數下降，抗凋亡相關基因表達增加，提示慢性阻塞性肺疾病繼發性紅細胞增多癥可能是促紅細胞生成素增加導致紅細胞異常增生和抗凋亡減少，并導致過度積累的雙重作用結果。

骨髓紅系細胞通過與造血微環境的相互作用維持機體內紅細胞的穩態。其過程復雜，涉及紅系細胞外的調節因子、細胞內的遺傳學和表觀遺傳學調控等多個環節[11]。缺氧是引起紅細胞增多的主要原因，主要有EPO介導的紅細胞增殖學說，低氧誘導因子1通過與促紅細胞生成素(EPO)的啟動子結合，提高EPO-mRNA活性，致EPO的分泌增加。但在HAPC患者中EPO水平不總是和紅細胞增生的數量相一致。其他可能性因素包括遺傳適應性、對EPO的反應性、造血生長因子、轉錄因子及造血系統微環境的調控等[12]。但紅細胞的數量的衡定是在骨髓紅細胞生成和外周凋亡之間保持平衡的結果，在骨髓紅系統分化調控的同時伴隨細胞凋亡的參與。在細胞凋亡的過程中，線粒體起著關鍵性的作用，細胞線粒體通透性的改變可以誘發細胞凋亡，Bcl-2 家族蛋白參與線粒體的這種通透性的改變[13，14]。線粒體膜的通透性受Bc1-2家族蛋白成員精確的調控，線粒體通透性轉變孔道可由Bc1-2家族蛋白誘導開放。缺氧誘導Bcl-2 表達，從而抑制線粒體釋放細胞色素C，降低caspase-3 的活性，抑制細胞凋亡[15]。

本研究發現，在COPD合并繼發性紅細胞增多的患者中，Bcl-2mRNA表達增高，提示抗凋亡因素也參與在心肺疾病導致紅細胞增多的過程。

心肺疾患導致的繼發紅細胞增多是紅細胞過度生成和凋亡減少共同作用的結果，COPD繼發紅細胞增多的細胞凋亡機制與其他疾病的凋亡有著相同或相似的信號傳導通路，它是一個復雜的、由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程。本研究初步探討了繼發性紅細胞增多癥對慢性阻塞性肺疾病患者呼吸功能和骨髓有核紅細胞凋亡及Bcl-2 mRNA的影響，詳細機理還有待進一步研究。

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Influence of Secondary polycythemia on respiratory function，apoptosis of bone marrow nucleated red blood cells and Bcl-2 mRNA in patients with COPD

Qi Yali，Xie Youbang，Gu Yuhai

(Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining，Qinghai 810007)

Objective The aim of the study was to investigate the impact of secondary polycythemia(SP)on respiratory function，bone marrow nucleated red blood cells apoptosis and Bcl-2 mRNA expression in male patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods To select 30 male simple fracture patients as control group，32 male COPD patients and 21 male COPD complicated with SP patients as COPD group and COPD+SP group.Pulmonary function(FEV1/FVC)of patients were evaluated using the spirometer.The apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells were measured by flow cytometry.Expression levels of Bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR.Results Respiratory function(FEV1/FVC)of COPD+SP group were lower than COPD group and the mMRC score were greater than that of COPD group(P<0.05).Apoptosis rate of bone marrow nucleated red blood cells with COPD+SP were significantly lower than that of the control group and COPD group.The expression levels of Bcl-2 mRNA were significantly higher than that of the control group and COPD group(P<0.05).Conclusions SP can affect the male respiratory function(FEV1/FVC)and increase the degree of dyspnea in COPD patients.Bcl-2 family molecules may be involved in abnormal apoptosis of marrow nucleated red blood cells in male patients with COPD complicated with SP.

COPD Secondary polycythemia Bone marrow nucleated red blood cells Cells apoptosis Bcl-2

R555

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.002

2016-01-09

※：青海省重點學科項目(呼吸科)(青財社字[2013]2578號)資助.*：通訊作者，主任醫師，Email：qhguyuhai@163.com 齊亞麗(1978～)，女，漢族，甘肅籍，碩士，主治醫師