IL-23R的表達及基因多態性與膿毒癥引起的急性肺損傷臨床預后相關性

孟建斌，孫麗萍，瓦永祿，劉麗莉，姚 茜

(青海紅十字醫院重癥醫學科)

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IL-23R的表達及基因多態性與膿毒癥引起的急性肺損傷臨床預后相關性

孟建斌，孫麗萍，瓦永祿，劉麗莉，姚 茜

(青海紅十字醫院重癥醫學科)

目的 研究IL-23R的表達及基因多態性與膿毒癥引起的急性肺損傷臨床預后相關性。方法 選取膿毒癥引起的急性肺損傷病人與健康者對照，分別抽取外周血并提取總RNA和DNA，利用PCR技術測定IL-23R的mRNA值；利用PCR結合測序技術測定IL-23R不同位點基因多態性。結果 膿毒癥引起的急性肺損傷病人IL-23R表達顯著上調，并且對30天死亡率有較強的預后評估作用；IL-23R基因的rs10889677和rs1004819位點與30天死亡率顯著相關。結論 IL-23R的表達及基因多態性與膿毒癥引起的急性肺損傷預后密切相關。

IL-23R 基因多態性 膿毒癥 急性肺損傷

目前國際上對膿毒癥引起的ALI/ADRS病人預后評判的標準多用APACHE I-IV評分系統[1]。ICU的臨床研究發現，相同分數的病人體現出的病理生理及治療預后存在巨大差異[2]。以往人們習慣性地將其歸因于環境因素，病人個體差異等。隨著分子生物學技術的發展，科學家發現，這種差異和病人的基因多態性存在很大聯系?；蚨鄳B性即在某隨機婚配的群體中，染色體同一基因座位點上有兩種或兩種以上基因型，它可決定人體對疾病的易感性。所以，探索關鍵基因的基因多態性與膿毒癥引起的ALI預后的關系，可為個體化用藥治療提供依據。目前，已報道與膿毒癥引起的ALI相關的基因多態性包括TNF、IL-1、IL-10、HSP-70等[1-3]。

IL-23R屬于促紅細胞生成素受體超家族中的一員，是致炎因子IL-23的異二聚體受體中特異性組成成分。其基因位于人1號染色體上，編碼區大小為150 kb左右。作為一種跨膜蛋白，它在人的T淋巴細胞、NK細胞、DC細胞和巨噬細胞的細胞膜上均有所表達。IL-23可與IL-23R結合，通過IL-23R介導的細胞內信號轉導實現調控免疫應答的功能[4]。在膿毒癥引起的ALI/ADRS疾病中，TH17細胞起著介導炎性反應的發生和發展的作用，從而造成肺臟的功能性損害。作為IL-23/TH17這一細胞軸通路的關鍵因素，IL-23R在膿毒癥引起的ALI/ADRS患者的表達情況，單核苷酸基因多態性分布情況以及其在發病中是否起到與其功能相對應的作用，是一項值得探討的課題。本項研究的目的是檢測膿毒癥引起的ALI/ADRS患者外周血白細胞中IL-23R的表達水平及單核苷酸基因多態性，并初步探討其與患者治療預后的相關性。

1 對象與方法

1.1 臨床病例選擇

膿毒癥引起的ALI/ADRS病人均收自青海紅十字醫院ICU。膿毒癥的定義及等級參考美國及歐洲胸科醫師學會和新柏林的定義。共有45例重度膿毒癥患者和113例普通膿毒癥患者被納入此項研究。該研究得到了青海紅十字醫院倫理委員會的批準，所有患者或其親屬代理人均簽署了知情同意書?；颊吣挲g、性別和BMI、APACHE II 評分等臨床數據如表1 所示。

Table 1 Clinical characteristics of severe sepsis and sepsis-induced ALI and healthy ±s)

1.2 試劑選擇

全血提取試劑盒購自QIAGEN公司；RNA提取試劑盒及PCR試劑購自TAKARA公司；IL-23R檢測的ELISA試劑盒購自R&D公司；Trizol購自Invitrogen公司。

1.3 外周靜脈血DNA提取

利用全基因組DNA提取試劑盒提取外周靜脈血基因組，具體方法如下：采集4 mL外周靜脈血于抗凝真空采血管中，置-20 ℃超低溫冰箱中備用。取血液樣本250 μL于1.5 mL的EP管中，加入細胞裂解液400 μL，顛倒混勾，離心(10，000r/min)1 min，除去上清液，剩細胞核沉淀，向離心后的細胞核沉淀中加入250 μL緩沖液1(出自全血基因組提取試劑盒)，震蕩混勻后，加入25 μL蛋白酶K溶液，EP管置于56 ℃水浴鍋(10min)，離心，加入緩沖液2(出自全血基因組提取試劑盒)以吸附柱離心方法收集DNA。DNA的濃度和純度用紫外分光光度計檢測，所提DNA置-20 ℃超低溫冰箱中備用。

1.4 外周靜脈血總RNA提取

每毫升全血加入1 mL Trizol，室溫下沉淀、溶解后，按說明抽提總RNA，以DU 800分光光度計定量，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性，放入凝膠成像儀拍照，置-70 ℃超低溫冰箱中備用。

1.5 RNA逆轉錄

根據濃度計算取500 μg相應體積的總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA。按下列組份在冰上配制10 μL反應體系的RT反應液：5×Prime Script Buffer 2 μL；Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL；Oligo dT Primer(50M)0.5 μL；Random 6 mers(100M)0.5 μL；ExScriptRTase(RNaseH free，200 U/l)0.25 μL；RNase Inhibitor(40U/l)；500 ng相應體積的總RNA；RNase Freed H2O 。逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5sec，4 ℃，反應結束后，樣品放入-20 ℃超低溫冰箱中備用。

1.6 實時定量PCR試驗

IL-23R的引物為：上游引物5′CAA GAA ACA GGC AAA AGG TA 3′；下游引物5′ATG TGA CCT GGG GAA CTG T 3′。PCR反應體系：SYBR Green Master Mix 2.5 μL；上游引物0.1 μL；下游引物0.1 μL；cDNA 1 μL，去離子水補齊至5 μL反應體系。PCR的反應擴增條件為：95 ℃ 15 s；(95℃ 15 s，60℃ 130 s)四十個循環，最后于72 ℃延伸5 min。輸入384孔板中需采集的孔位及檢測基因類別，每個標本均作3個復孔，計算時取平均值。每次PCR反應均設置無cDNA的樣本作陰性對照，無cDNA無引物的空白SYBR master mix作空白對照。針對RNA產物，Sequence Detector 1.7軟件分析其CT值，并計算RQ值以對其mRNA進行相對定量。針對DNA產物，通過膠回收后送往上海生工公司進行測序，分析單核苷酸位點基因的多態性。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 膿毒癥引起的ALI/ADRS病人外周血中IL-23R的表達量顯著升高

膿毒癥患者、重度膿毒癥患者和健康志愿者的臨床特征如表1所示。膿毒癥組男性62例，女性51例；重度膿毒癥組男性23例，女性22例。本實驗共招募健康志愿者男性12例，女性9例。年齡、性別、身體質量指數(BMI)等數據組間無顯著差異。QRT-PCR結果顯示，與健康對照組相比，重度膿毒癥及膿毒癥引起的ALI/ADRS患者外周血中IL-23R的表達量顯著升高。

隨訪23例病情有所好轉的病例，其中重度膿毒癥引起的ALI患者10例，膿毒癥引起的ALI患者13例。發現治療后的患者IL-23R值顯著低于發病初期時，這說明IL-23R 的表達在發病期達到峰值，而在恢復期趨于回調，提示IL-23R的動態變化與預后存在相關性。

Table 2 IL-23R expression alternation before and after treatment among 23 cases of sepsis-induced acute lung injury ±s)

2.2 IL-23R的表達與膿毒癥引起的ALI/ADRS病人預后關系

為了研究IL-23R的表達與膿毒癥引起的ALI/ADRS病人30天死亡率的關系，我們以患者是否死亡為標準繪制了ROC曲線。并利用AUC值(即ROC曲線下部面積)比較其與APACHE II打分的優劣。IL-6作為一種新近發現的診斷標志物，也可用于比較對照。我們發現IL-23R的AUC值為0.8[95% CI(0.717-0.883)]，這個值較APACHE II打分的AUC值略低0.814[95% CI 0.718-0.911)](P<0.05)，但比IL-6的AUC值[0.753(95% CI 0.663～0.843)]高(圖1)，這說明IL-23R的表達可以作為判斷治療預后的標志物之一。

圖1 IL-23R表達、APACHE II打分及IL-6表達對30天生存率的ROC曲線圖

Figure 1 The ROC curve for IL-23R expression，APACHE II score，and IL-6 expression related to 30-day mortality

2.3 IL-23R基因多態性與膿毒癥引起的ALI/ADRS病人預后關系

我們將患者分為死亡組及非死亡組，并比較其與IL-23R基因多態性的相關性。我們發現與死亡發生最相關的單核苷酸多態性為rs10889677位點；rs1004819位點的A發生頻率在死亡組也顯著高于對照組；其他位點并未發現顯著的相關性(表3)。

表3 rs10889677和rs1004819位點單堿基及基因亞型分布比較(%)

Table 3 Allele and genotype distribution of rs10889677 and rs1004819(%)

3 討論

利用血液中的標志物，輔助APACHE II打分，判斷膿毒癥引起的ALI/ADRS治療預后，對提高該疾病的生存率和治愈率具有重要的意義。本研究發現IL-23R的表達及基因多態性與膿毒癥引起的ALI/ADRS生存率存在密切的相關性。IL-23R髓系細胞，如單核細胞、樹突狀細胞、T細胞、NK細胞等低水平表達，其結構分為跨膜區和胞質區：細胞內的胞質區包含7個酪氨酸殘基，這個區域已被證明可引起下游一系列的信號轉導。IL-23R可與JAK2相互作用，導致下游的STAT信號家族及JAK2、TYK2的激活。 這其中最重要的信號通路為STAT3通路，被激活的STAT3可誘導記憶性T細胞分化為Th17細胞，并促進其分泌IL-17，從而引發下游一系列相關免疫應答及免疫紊亂。由此可見，IL-23R是Th17細胞亞群關鍵的調控作用因子。目前，IL-23R的免疫調控作用已經在多種自身免疫病中得到證實，例如Cua等人發現自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠體內的IL-23R對發病起著重要的調控作用。某些臨床研究發現IL-23R單克隆抗體可以有效治療自身免疫性疾病，提出通過阻斷IL-23R介導的下游免疫信號通路可提高免疫病療效的新機制。

鑒于膿毒癥引起的ALI/ADRS的發病機制和預后均與機體免疫應答存在極大的關聯性，我們推測在這些患者中也存在著IL-23R/Th17軸的異常。本實驗的結果提示，膿毒癥引起的ALI/ADRS患者組的IL-23R的mRNA表達明顯高于對照組，差異有統計學意義，提示在膿毒癥引起的ALI/ADRS者外周血中可能存在著IL23R-Th17細胞軸的異常。

IL-23R基因多態性也被報道與自身免疫性疾病有明顯聯系，為了進一步證實IL-23R與膿毒癥引起的ALI/ADRS的相關性，我們檢測了部分IL-23R的SNP基因多態性，發現rs10889677和rs1004819與患者的生存率顯著相關。Rs10889677位于IL-23R的3′非編碼區域，被證明可提高其mRNA的表達，并改變microRNA的調控能力。同時，rs10889677突變，可調控T細胞向Th17的分化，影響IL-17等細胞因子的表達。Rs1004819位于IL-23R基因的內含子部分，可調控IL-23R的mRNA表達含量。以上結果也證實，IL-23R在膿毒癥引起的ALI/ADRS發病過程中起著重要的調控作用，其基因多態性和表達含量，是判斷病情發展和預后的重要指標。

[1]Zhang Z，Chen K，Chen L.APACHE III Outcome Prediction in Patients Admitted to the Intensive Care Unit withSepsis Associated Acute Lung Injury.Plos One，2015，30，e0139374.

[2]Ware LB，Koyama T，Billheimer DD，et al.Prognosticandpathogenetic valueof combining clinical and biochemical indices in patients with acute lung injury.Chest，2010，137，288-96.

[3]Yi R，Li Y，Wang FL，et al.MicroRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers in colorectal cancer.World J Gastrointest Oncol，2016，8，330-40.

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IL-23R expression and genetic polymorphisms and their relationship with sepsis-induced acute lung injury

Meng Jianbin，Sun Liping，Wa Yonglu，Liu Lili，Yao Qian

(Department of Critical Care Medicine，Qinghai Red Cross Hospital)

Objective To study the association of interleukin-23 receptor(IL-23R)expression and genetic polymorphisms with sepsis-induced acute lung injury(ALI).Methods 45 cases of patients with severe sepsis and 113 cases of general sepsis caused ALI and 21 cases of healthy volunteers were enrolled in this study.Plasma IL-23R mRNA were determined by qRT-PCR.Genotyping analysis of IL-23R was performed using PCR-followed sequencing.Results The relative plasma IL-23R concentrations were significantly increased in severe sepsis and sepsis-induced ALI，compared with control subjects，and the expressions were highly related with the 30-day mortality rate.rs10889677 and rs1004819 genetic Polymorphisms were associated with the 30-day mortality rate.Conclusion There is close association between IL-23R expression and genetic polymorphisms and the prognosis of sepsis-induced acute lung injury.

IL-23R Genetic Polymorphisms Sepsis Acute Lung Injury

R392

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.010

2015-12-13

孟建斌(1972～)，男，漢族，河南籍，副主任醫師