microRNA在法醫學中的研究進展

董智杰綜述，吳 岳審校

(青海大學醫學院)

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microRNA在法醫學中的研究進展

董智杰綜述，吳 岳審校

(青海大學醫學院)

miRNAs是一類由22個左右核苷酸組成的單鏈內源性非編碼小RNA分子，參與轉錄后基因表達的調控作用，廣泛存在于動植物和病毒中，其表達具有高度的組織特異性和階段特異性[1-2]。自miRNA于1993年被首次發現以來[3]，人們發現，miRNA不僅參與脂質代謝[4]、細胞的發育及干細胞的維持等眾多生理過程[5]，還參與腫瘤[6]、糖尿病[7]、心血管疾病[8]等病理過程。隨著對miRNA研究的逐漸深入，miRNA的應用逐漸拓展到法醫學領域。本文將從體液來源鑒定、死亡時間推斷、死亡原因分析、損傷時間推斷、精神疾病的鑒定及年齡推斷等方面對miRNA在法醫學中的應用現狀及可能存在的應用空間進行綜述，以期為今后miRNA在法醫學中的應用提供幫助。

1 體液來源鑒定

對案發現場遺留的體液進行準確的鑒定對案發現場的重建、案發過程的推斷及證據鏈的完善具有重要意義。法醫體液鑒定方法包括傳統的免疫學法或生化檢測分析法，但這些方法存在特異性低、需要檢材量大、不適合腐敗檢材等缺點[9]。之后，有學者提出用靈敏度高的光譜法進行體液鑒定，但此方法不能區分非人類檢材并會破壞檢材的DNA[9]。近年來，具有組織特異性的mRNA被用來替代傳統方法進行體液鑒定，但mRNA易受溫度、濕度及內外源RNA酶等因素的影響而發生降解，因此同樣不適合對腐敗檢材檢測[10]。miRNA的表達具有組織特異性，且其片段小，穩定不易降解，不受溫度、死因、年齡等的影響，適合腐敗檢材，因此miRNA比mRNA更適合作法醫體液鑒定[11]。

Hanson等[12]于2009年首次應用miRNA進行法醫相關體液鑒定，從452個人類miRNA中篩選出9個分別在外周血、精液、唾液、陰道分泌物、經血中特異性表達的miRNA(見表1)，其靈敏度達到50 pg總RNA。

繼而，Hanson等[13]又從1198個人類miRNA中，篩選出3個miRNA(miR144-5p、miR144-3p和miR185-5p)，并以此建立Logistic回歸模型，該模型對經血鑒定的準確度高達100%，其檢出限小于1 ng總RNA，從而在一定程度上解決了經血和陰道分泌物不易區分的難題。Zubakov等[14]從718個人類miRNA中篩選出9個用于體液鑒定的miRNA(見表1)，其靈敏度高達0.1 pg總RNA，且在實驗室條件下保存1年之久的體液miRNA未發生明顯降解。該研究中只有精液標記物(miR-135a，miR-10a)與Hanson等[12]的結果(精液標記物為miR-135b和miR-10b)相關，其他的miRNA標記物沒有重疊。原因可能是Hanson等[12]用SYBR Green染料法而本實驗用TaqMan探針法，且本實驗的樣本量小，不能排除miRNA表達的個體差異。Wang等[15]用TaqManRT-qPCR技術，通過建立效率校準模型證明miR-16在靜脈血中特異性表達，而miR-658和miR-205不具有唾液特異性，與Hanson等[12]的研究結果不一致，同樣可能是實驗方法的不同造成的，此模型可提高miRNA表達數據分析的準確性和可靠性。此后，Wang等[16]在檢測人唾液特異性miRNA時提出聯合應用兩種或三種miRNA階梯式進行體液鑒定的新方法，不僅可以鑒定唾液，而且可以有效地鑒定其余四種體液，為體液鑒定提供了新思路。Li等[17]用線性反轉錄引物建立了基于體液鑒定的miRNA和DNA共提取及共分析策略，從同一樣本中分析獲得了4個miRNA標記物(見表1)和DNA STR譜，此方法不僅節省時間和檢材，還可以一次性完成體液鑒定及STR分型。Sauer等[18]提出了檢測相關體液miRNA表達水平的標準化策略，包括樣本的采集、保存及目的基因的提取均采用此標準化協議，以將外部差異降到最低；同時選擇合適的內源性參考基因，以補償內源性非生物差異。此后，Sauer等[19]篩選出4種miRNA用以區分精液、唾液、陰道分泌物、靜脈血、經血：miR-891 a-5 p用以準確鑒定精液；miR-144-3 p和miR-203 a-3 p結合，通過判別函數分析，區分靜脈血和月經血；miR-203 a-3p和miR-124-3 p結合，通過判別函數分析，區分唾液和陰道分泌物。但在此項研究中，miR-658在唾液中缺乏特異性擴增，與Wang等[15]人的研究結果一致，而與Hanson等[12]人的研究結果矛盾，可能是由于Sauer和Wang等人使用TaqMan探針法，而Hanson等人用SYBR Green染料法所致。上述研究所用保存36年之久的外周血樣本其miRNA未見明顯降解。[19]

表1 miRNA用于體液鑒定的不同結果

Table 1 miRNA is used for different results of body fluid identification

由此可見，miRNA在體液鑒定方面有良好的應用價值。不同團隊研究結果不一的可能原因是實驗方法、檢測平臺及統計分析模型不同所致。因此，從最初的樣本處理到實驗方法、內參基因的選擇及最后的統計分析模型的建立，均需要制定規范統一的準則，以提高結果的可靠性。

2 死亡時間推斷

死亡時間推斷對確定案發時間、劃定偵察范圍、認定和排除犯罪嫌疑人有重要意義。傳統死亡時間的推斷可根據尸體現象、胃內容物消化程度、昆蟲發育情況等，但這些方法易受主觀因素和環境因素的影響。近年來，隨著分子生物學的快速發展，研究人員通過測定蛋白質及DNA、mRNA的含量來推斷死亡時間，但上述分子不穩定，易受環境因素及酶的影響而發生降解，使其在死亡時間推斷方面存在一定的局限性。miRNA因其片段短，結構穩定，且不易受外界環境因素的影響[11]，被視為死亡時間推斷的一類新分子。

李文燦等[20]通過RT-qPCR檢測單一溫度下大鼠心肌組織miR-1-2的含量與死亡時間的關系：死后120 h內miR-1-2含量保持相對穩定，在死后早期可以作為內參基因以校正其他分子的表達水平；在死亡120 h后表現出隨時間的延長而降解的趨勢，提示miR-1-2可用來推斷晚期死亡時間。此后，大批學者[11，21-23]進一步研究了在不同溫度下不同組織的miRNA含量與死亡時間的關系：結果均表明，miRNA不受溫度的影響，在死后相當一段時間內不發生降解，可作為內參標記物或推斷晚期死亡時間的標志物，與李文燦等[20]的研究結果一致。

Kakimoto等[24]研究了用福爾馬林固定長達3年之久的急性心肌梗死病人心肌組織中miRNA的穩定性，發現miR-191和miR-26 b的含量穩定，未發生降解，并用作為內參基因。進一步證明miRNA的穩定性及作為內參基因的可靠性。

Sharma等[25]研究發現小鼠心臟和大腦組織中AATF RNA基因組(包括AATF mRNA及其編碼的miR-2909)的晝夜節律與死亡時間具有協同性，為死亡時間的推斷提供了更精確可靠的方式，同時為miRNA在死亡時間推斷方面的應用提供了新思路。

目前，miRNA在死亡時間推斷方面的研究還局限于動物實驗和單一環境，與人體和自然環境存在較大差異，需進一步對人體標本和環境溫度濕度及含氧量進行綜合研究，以提高準確性。

3 死亡原因分析

全面正確的死因分析為案件的偵察、審理提供有力的科學依據，關系到案件的性質及對當事人的定罪量刑，因此死因分析至關重要。常規的死因分析主要通過尸體解剖和病理檢查進行，目前免疫組織化學法和分子生物學法被用來進行死因分析的研究。近年來的研究發現，miRNA可作為死因的標記物，為死因分析提供輔助參考依據，有望成為死因分析的新手段。

Courts等[26]研究發現在嬰兒猝死綜合癥中，心臟特異性miR-1和腦組織特異性let-7 b的表達水平顯著上調。表明miR-1和let-7 b可作為嬰兒猝死綜合癥的分子標記物，為嬰兒的死因分析提供輔助參考依據。Sharma等[27]在研究砷毒性RNA組學調節宿主免疫應答的過程中發現，亞砷酸鈉中毒小鼠miR-2909的表達升高。提示miRNA含量的變化在毒物慢性中毒中有一定價值，可以輔助法醫進行毒物分析及死亡原因推斷。Yu等[28]發現了8種miRNA在淡水溺死模型中表達量增加，而在海水中減少，其中，miR-706在淡水溺死模型中的表達量比在對照組和海水溺死模型中的表達量均高，可以作為溺死模型鑒定的潛在分子標記物。Schober等[29]研究發現，用miR-138/miR-744或miR-195/miR-324-5 p可完全區分創傷性額皮質損傷死與自然死亡者。提示miRNA可用作創傷性腦損傷的標志物或評估腦損傷的嚴重程度，為死因分析提供依據。

4 損傷時間推斷

準確推斷損傷時間可以鑒別生前傷和死后傷以及確定損傷后存活時間，對于案件重建和偵破有重要意義。損傷時間推斷的方法包括肉眼觀察、顯微鏡檢查和酶組織化學法、生物化學法、免疫組織化學、分子生物學法檢測等，還有學者測定創口中mRNA、DNA含量來推斷損傷時間。近年來，有研究顯示miRNA表達譜在損傷后變化顯著，可用來推斷損傷時間。

彭濤等[30]研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷大腦皮質miRNA表達量的變化，用miRNA芯片篩選出27個miRNA表達上調超過2倍，60個下調超過2倍，又用RT-qPCR檢測所選擇的9個miRNA，結果與miRNA芯片趨勢相同。提示miRNA的量在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中顯著變化，深入研究miRNA表達量的變化規律，可以揭示其與損傷時間之間的關系。

Sun等[31]研究了創傷性腦損傷后不同時間點大鼠海馬miRNA譜的表達變化，發現17種miRNA在各時間點均有顯著性變化，提示損傷后miRNA的表達變化規律具有很好的時序性。并指出miR-142-3 p和miR-221可作為創傷性腦損傷的潛在生物標記物。

5 精神疾病鑒定

確定被鑒定人在實施危害行為時的精神狀態及刑事責任能力是法醫精神病學的重要任務之一，這決定了被鑒定人是否要承擔刑事責任。近年來的研究表明，精神病患者與miRNA的表達水平具有一定的關聯性，可為精神疾病的鑒定提供新的依據。

Moreau等[32]研究了精神分裂癥和躁郁癥患者死后腦組織435種miRNA表達水平的變化，其中19%的miRNA表達水平下降，在躁郁癥患者中表現得尤為明顯，表明miRNA可作為精神疾病的一種新標記物。Liang等[33]研究發現，let-7家族啟動子的基因多態性會增加重度抑郁癥的風險。因此，可以通過測定let-7的基因型來輔助診斷是否患有重度抑郁癥，進一步證實miRNA與精神疾病緊密相關，可為精神疾病的鑒定提供新的思路。

6 年齡推斷

年齡的推斷對確定尸源及判斷刑事責任能力至關重要，目前主要通過骨骼和牙齒的形態特征推斷年齡，但這些方法對生物痕跡身源者的年齡推斷不適用。為滿足法醫實踐的需求，研究者們檢測到一些年齡相關的分子，其中包括miRNA，可作為年齡推斷的參考標記物。

Hooten等[34]研究發現外周血單核細胞中9種miRNA(miR-103，miR-107，miR-128，miR-130a，miR-155，miR-24，miR-221，miR-496，miR-1538)的表達豐度在老年組中顯著低于年輕組，提示在人類的衰老過程中伴隨著miRNA表達的變化，miRNA可作為年齡推斷的標記物。Hackl等[35]研究細胞和機體衰老模型中miRNA表達量的變化，發現miR-17、miR-19 b、miR-20 a和miR-106 a均呈現出下調，以miR-17下調最為顯著，進一步證實miRNA的表達量具有隨年齡變化的規律。同樣，Li等[36]研究發現，mir-223、let-7 d和mir-130 a調節人類衰老過程；Rubie等[37]提出，miR-496通過控制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與人類衰老的調節過程。這些研究結果提示，miRNA可作為年齡推斷的新型標記物，為年齡的推斷提供新思路。

綜上所述，miRNA的應用在法醫學中表現出巨大潛力，涉及法醫學中的多個方向，為體液鑒定、死亡時間推斷、死亡原因分析、損傷時間推斷、精神疾病鑒定及年齡推斷提供了一個新的視角。但目前對其研究仍處于實驗室階段，且不同團隊得出的結果各異。因此，如何將實驗室研究結果應用于法醫學實踐當中且建立可靠的標準實驗流程是未來研究的重點。由于miRNA參與眾多疾病的發生發展過程，在機體不同的病理生理狀態下其表達量有差異，因此會影響其在法醫學中應用的準確性，故只能對健康個體進行miRNA相關法醫學推斷。

[1]Yates L A，Norbury C J，Gilbert R J C.The long and short of microRNA[J].Cell，2013，153(3)：516-519.

[2]Mendell J T，Olson E N.MicroRNAs in stress signaling and human disease[J].Cell，2012，148(6)：1172-1187.

[3]Lee R C，Feinbaum R L，Ambros V.The C.elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75(5)：843-854.

[4]Lynn F C.Meta-regulation：microRNA regulation of glucose and lipid metabolism[J].Trends in Endocrinology & Metabolism，2009，20(9)：452-459.

[5]Carrington J C，Ambros V.Role of microRNAs in plant and animal development[J].Science，2003，301(5631)：336-338.

[6]Hata A，Lieberman J.Dysregulation of microRNA biogenesis and gene silencing in cancer[J].Sci.Signal，2015，8：368.

[7]Warren C R，Cowan C A.Type 1 Diabetes and MicroRNA：It’s Complicated[J].Cell Metabolism，2015，22(2)：202-203.

[8]Olson E N.MicroRNAs as therapeutic targets and biomarkers of cardiovascular disease[J].Science translational medicine，2014，6(239)：239ps3-239ps3.

[9]馬麗莉，馬紅杜，黃代新.人體組織/體液來源的法醫學鑒定[J]. 中國法醫學雜志，2013，4：011.

[10]Wang Z，Zhang S H，Di Z，et al.Messenger RNA profiling for forensic body fluid identification：research and applications[J].Fayixuezazhi，2013，29(5)：368-374.

[11]呂葉輝.運用RNA降解規律構建數學模型推斷死亡時間[D].上海：復旦大學，2014.

[12]Hanson E K，Lubenow H，Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Analytical biochemistry，2009，387(2)：303-314.

[13]Hanson E K，Mirza M，Rekab K，et al.The identification of menstrual blood in forensic samples by logistic regression modeling of miRNA expression[J].Electrophoresis，2014，35(21-22)：3087-3095.

[14]Zubakov D，Boersma A W M，Choi Y，et al.MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J].International journal of legal medicine，2010，124(3)：217-226.

[15]Wang Z，Luo H，Pan X，et al.A model for data analysis of microRNA expression in forensic body fluid identification[J].Forensic Science International：Genetics，2012，6(3)：419-423.

[16]Wang Z，Zhang J，Wei W，et al.Identification of saliva using MicroRNA biomarkers for forensic purpose[J].Journal of forensic sciences，2015，60(3)：702-706.

[17]Li Y，Zhang J，Wei W，et al.A strategy for co-analysis of microRNAs and DNA[J].Forensic Science International：Genetics，2014，12：24-29.

[18]Sauer E，Madea B，Courts C.An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensically relevant body fluids[J].Forensic Science International：Genetics，2014，11：174-181.

[19]Sauer E，Reinke A K，Courts C.Differentiation of five body fluids from forensic samples by expression analysis of four microRNAs using quantitative PCR[J].Forensic Science International：Genetics，2016，22：89-99.

[20]李文燦，馬開軍，張萍，等.大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的降解與死亡時間的相關性[J].法醫學雜志，2010(6)：413-417.

[21]潘暉，張恒，呂葉輝，等.不同溫度下大鼠皮膚5種RNA指標與PMI的相關性[J].法醫學雜志，2014，30(4)：245-249.

[22]Lv Y，Ma K，Zhang H，et al.A time course study demonstrating mRNA，microRNA，18S rRNA，and U6 snRNA changes to estimate PMI in deceased rat′s spleen[J].Journal of forensic sciences，2014，59(5)：1286-1294.

[23]Ma J，Pan H，Zeng Y，et al.Exploration of the R code-based mathematical model for PMI estimation using profiling of RNA degradation in rat brain tissue at different temperatures[J].Forensic Science，Medicine，and Pathology，2015，11(4)：530-537.

[24]Kakimoto Y，Kamiguchi H，Ochiai E，et al.MicroRNA stability in postmortem FFPE tissues：quantitative analysis using autoptic samples from acute myocardial infarction patients[J].PloS one，2015，10(6)：e0129338.

[25]Sharma S，Singh D，Kaul D.AATF RNome has the potential to define post mortem interval[J].Forensic science international，2015，247：e21-e24.

[26]Courts C，Grabmüller M，Madea B.Dysregulation of heart and brain specific micro-RNA in sudden infant death syndrome[J].Forensic science international，2013，228(1)：70-74.[27]Sharma S，Kaul D，Singh D.Arsenic toxi-RNomics has the ability to tailor the host immune response[J].Experimental and molecular pathology，2015，99(2)：360-364.

[28]Yu S Y，Na J Y，Lee Y J，et al.Forensic application of microRNA-706 as a biomarker for drowning pattern identification[J].Forensic science international，2015，255：96-101.

[29]Schober K，Ondruschka B，Dreβler J，et al.Detection of hypoxia markers in the cerebellum after a traumatic frontal cortex injury：a human postmortem gene expression analysis[J].International journal of legal medicine，2015，129(4)：701-707.

[30]彭濤，賈延劼，文全慶，等.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織小RNA表達的變化[J].中國當代兒科雜志，2010(5)：373-376.

[31]Sun T，Chen X，Liu Z，et al.Expression profiling of microRNAs in hippocampus of rats following traumatic brain injury[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology[Medical Sciences]，2014，34：548-553.

[32]Moreau M P，Bruse S E，David-Rus R，et al.Altered microRNA expression profiles in postmortem brain samples from individuals with schizophrenia and bipolar disorder[J].Biological psychiatry，2011，69(2)：188-193.

[33]Liang Y，Zhao G，Sun R，et al.Genetic variants in the promoters of let-7 family are associated with an increased risk of major depressive disorder[J].Journal of affective disorders，2015，183：295-299.

[34]Hooten N N，Abdelmohsen K，Gorospe M，et al.microRNA expression patterns reveal differential expression of target genes with age[J].PloS one，2010，5(5)：e10724.

[35]Hackl M，Brunner S，Fortschegger K，et al.miR-17， miR-19 b，miR-20 a，and miR-106 a are down-regulated in human aging[J].Aging cell，2010，9(2)：291-296.

[36]Li C W，Wang W H，Chen B S.Investigating the specific core genetic-and-epigenetic networks of cellular mechanisms involved in human aging in peripheral blood mononuclear cells[J].Oncotarget，2016，7(8)：8556-8579.

[37]Rubie C，K?lsch K，Halajda B，et al.microRNA-496-A new，potentially aging-relevant regulator of mTOR[J].Cell Cycle，2016，15(8)：1108-1116.

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.013

2016-05-02

董智杰(1990～)，女，漢族，河南籍，2014級科學班研究生