不同類型支原體肺炎外周血TIM和TLR基因表達的變化及其意義①

樊 青 顏 萍 李培杰

(濟南市婦幼保健院兒科，濟南250001)

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不同類型支原體肺炎外周血TIM和TLR基因表達的變化及其意義①

樊 青 顏 萍 李培杰

(濟南市婦幼保健院兒科，濟南250001)

目的：探討不同類型支原體肺炎患兒外周血Toll受體2、4和Tim、1、3家族基因的變化及其意義。方法：隨機選取自2013年3月～2014年3月在濟南市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共56例，將入選的56例根據X線影像學改變分為兩組：表現為沿支氣管分布的結節狀、點片狀密度增高影或伴網格狀、條索狀間質改變者作為支氣管肺炎組(40例)，表現為節段性、大葉性實變者作為節段性肺炎組(16例)。同時，選取性別和年齡與支原體患兒組匹配的健康查體兒童30例作為對照組。收集外周靜脈全血。抽提總RNA，采用qRT-PCR檢測TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對表達量,比較各組之間TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對表達量的差異。結果：(1)支原體肺炎組及MP-支氣管肺炎組外周血細胞中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-l mRNA相對表達值顯著高于健康對照組。(2)MP-節段性肺炎組TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量的顯著高于健康對照組。(3)MP-節段性肺炎組Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對表達量的顯著高于MP-支氣管肺炎組。結論：不同類型的支原體肺炎患兒外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1基因均有過度表達,Tim-1、Tim-3基因在肺部感染重癥患兒有過度表達，TLR2、4受體和Tim1、3家族基因參與不同類型的支原體肺炎的感染過程。

肺炎，支原體；支氣管肺炎；節段性肺炎；基因表達；qRT-PCR

肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，MP)感染引起的支原體肺炎是兒童常見的一種社區獲得性肺炎，有報道顯示國內發病率19.6%～21.9%，流行年度最高可達33.1%[1]，大多數肺炎支原體的臨床表現為良性進程，有良好的預后。但近年來發現，很多影像學表現為節段性、大葉性實變者肺炎的患兒臨床中毒癥狀重、病程遷延，可伴有多系統、多器官的損害，直接影響了疾病的預后[2]。

支原體入侵宿主細胞后，征服固有免疫和適應性免疫系統的多種宿主防御機制，建立長期感染，Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLRs)是新近發現的一種天然免疫模式識別受體，在對病原微生物的識別和跨膜信號轉導過程中，Toll樣受體作為功能受體，既引起天然免疫又能進一步啟動獲得性免疫，在機體的抗感染免疫過程中具有重要意義[3]。輔助T細胞在支原體感染的細胞免疫中起主要作用,直接造成了呼吸系統的免疫損傷[4]。Tim基因家族是T細胞亞群依賴的免疫應答中的新的關鍵性調節因子，其家族成員各自表達于Th1和Th2細胞，調節Th1和Th2細胞介導的免疫應答，參與維持體內Th1/Th2平衡。

本研究針對不同X線影像學表現類型的支原體肺炎，研究其外周血中TLR樣受體及Tim家族的變化，對于揭示支原體感染造成的免疫損傷具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 資料 支原體肺炎組：病例選自2013年1月至2014年6月在濟南市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共56例，其中男32例，女24例。平均年齡(3.72±0.89)歲，符合《實用兒科學》支原體肺炎診斷標準[5],血清MP-IgM抗體滴度>20 bu/ml(陽性),排除其他細菌、病毒、衣原體感染;肺外并發癥診斷排除其他病因所致各系統損害。將入選的56例根據X線影像學改變分為兩組：表現為沿支氣管分布的結節狀、點片狀密度增高影或伴網格狀、條索狀間質改變者作支氣管肺炎組(40例)，表現為節段性、大葉性實變者作為節段性肺炎組(16例)。

健康對照組：選取同期體檢的30例健康兒童為對照組，男18例，女12例，平均年齡(3.85±1.26)歲，均為我院兒科兒保門診經健康體檢合格的正常兒童、無心、肝、肺、腎等重要臟器疾患，肝、腎功能試驗正常，近期無任何感染病史。

1.2 方法

1.2.1 采用一次性抗凝采血管采集外周靜脈血4 ml，利用Pure血液總RNA提取試劑盒，于采集后2 h內用Trizol法提取血細胞總RNA，操作嚴格按照說明書的步驟進行。提取完畢后，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度，-80℃保存備用。

1.2.2 采用qRT-PCR法來評估檢測患兒外周血中TLR2、4和Tim1、3基因的相對表達量，在這項研究中使用的引物見表1。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的總體積為25 L[12.5 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，1 μl引物(f)，1 μl引物(R)和2 μl cDNA]。混合是在lightcycler480 qRT-PCR系統反應(Roche公司，德國),95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；40周期；95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃ 40 s，用β-actin為內參基因。所有的反應重復3次。最后，利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 不同類型支原體肺炎的一般特點及實驗室檢查MP-支氣管肺炎組的平均年齡小于MP-節段性肺炎組；MP-節段性肺炎組總的熱程和住院時間較MP-支氣管肺炎組延長；MP-節段性肺炎組C-反應蛋白、ESR顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，具體見表2。

2.2MP-肺炎與健康對照組相比，MP-肺炎外周血細胞中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA的相對表達量顯著高于健康對照組(P<0.05),具體見表3。

2.3MP-節段性肺炎組與健康對照組相比，MP-節段性支原體肺炎外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量顯著高于健康對照組(P<0.05),具體見表4。

表1 TLR-2、TLR-4、Tim-1和Tim-3的mRNA引物序列

Tab.1 mRNA primer sequence of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3

PrimersPrimersequenceTim1F5'-GAACATAGTCTACTGACGGCCAATAC-3'Tim1R5'-GAACCTCCTTTTTGAAGAAATACTTTT-3'Tim3F5'-TCCAAGGATGCTTACCACCAG-3'Tim3R5'-GCCAATGTGGATATTTGTGTT-3'β-actinF5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3'β-actinR5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'TLR2F5'-TGATGCTGCCATTCTCATTC-3'TLR2R5'-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3'TLR4F5'-TTGAGCAGGTCTAGGGTGATTGAAC-3'TLR4R5'-ATGCGGACACACACACTTTCAAATA-3'

表2 MP-支氣管肺炎與MP-節段性肺炎的臨床特點對比

Tab.2 Clinical features comparison of MP-bronchopneu-monia and MP-segmental pneumonia

OutcomemeasuresMP-broncho-pneumonia(n=40)MP-segmentalpneumonia(n=16)tPAge(year)3.3±1.24.6±0.83.980.002Totalfeverprocess(day)4.5±1.56.7±2.24.3160.001HLOS(day)7.5±1.310±1.85.80.001WBC(×109)6.67±0.87.38±1.12.680.0096CRP(mg/L)7.6±2.312.5±2.76.850.001ESR(mm/h)21±3.526±2.25.290.001

表3 MP-肺炎與健康對照組外周血TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3的相對表達量的對比

Tab.3 Relative expression comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 mRNA levels in peripheral blood of MP-pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-pneumoniagroup(n=56)tPTLR20.03846±0.00360.05122±0.0017273.6120.0005TLR40.01078±0.0018130.01774±0.0016782.4350.0172Tim10.0002334±0.000030470.0004287±0.00001696.0880.0001Tim30.004874±0.00047940.004785±0.00047941.9370.8467

表4 MP-節段性肺炎組與健康對照組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量的對比

Tab.4 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-segmental pneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.03846±0.00360.05381±0.0036562.7320.009TLR40.01078±0.0018130.01792±0.0021272.4370.0189Tim10.0002334±0.000030470.0005303±0.000032726.1650.0001Tim30.004874±0.00047940.006191±0.000225510.350.0001

表5 MP-支氣管肺炎組與健康對照組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量的對比

Tab.5 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and healthy group

TestindexHealthygroup(n=30)MP-bronchopneumoniagroup(n=40)tPTLR20.03846±0.00360.05018±0.0019333.060.0032TLR40.01078±0.0018130.01767±0.0020872.3950.0194Tim10.0002334±0.000030470.000388±0.000015844.8190.0001Tim30.004874±0.00047940.004224±0.00023321.3160.1927

2.4 MP-支氣管肺炎組與健康對照組相比，MP-支氣管肺炎組外周血中，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相對表達量顯著高于健康對照組(P<0.05),具體見表5。

2.5 MP-支氣管肺炎組與MP-節段性肺炎組相比，MP-節段性支原體肺炎外周血中，Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量顯著高于MP-支氣管肺炎組(P<0.05),具體見表6。

表6 MP-節段性肺炎組和MP-支氣管肺炎組外周血TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量的對比

Tab.6 Comparison of TLR-2,TLR-4,Tim-1 and Tim-3 relative mRNA expression levels in peripheral blood of MP-bronchopneumonia group and MP-segmental pneumonia group

TestindexMP-bronchopneu-moniagroup(n=40)MP-segmentalpneumoniagroup(n=16)tPTLR20.05018±0.0019330.05381±0.0036560.94730.3477TLR40.01767±0.0020870.01792±0.0021270.94410.0700Tim10.000388±0.000015840.0005303±0.000032724.3870.0001Tim30.004224±0.00023320.006191±0.00022554.9590.0001

表7 MP-肺炎患兒基因相對表達量與MP滴度的相關分析

Tab.7 Correlation analysis between relative expression levels of genes and MP titers in MP-pneumonia children

GenetestvalueMPTitersRsPTLR20.12060.007TLR40.014550.3628Tim10.2220.0002Tim30.0349810.1562

2.6 MP-肺炎患兒外周血中，TLR-2mRNA、TLR-4mRNA和Tim-1mRNA、Tim-3mRNA的相對表達量與MP滴度的相關性研究發現，TLR-2mRNA和Tim-1mRNA的相對表達量隨著MP感染滴度的增加而增加，結果見表7。

3 討論

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是已知的介于細菌和病毒之間的能獨立生活的最小病原微生物，它黏附于黏膜上皮細胞上，釋放毒性代謝產物，導致纖毛運動減弱、上皮細胞損傷，同時繼發體液和細胞免疫反應，進一步損傷肺組織并導致肺外靶器官損傷。

在支原體肺炎病程初期，X線表現為肺紋理的增粗、增多，主要是單核細胞和淋巴細胞的浸潤，使得支氣管與細支氣管發生充血與水腫，若病情未得到控制，淋巴細胞和單核細胞將進一步浸潤，其炎性滲出物不止局限于肺間質，并向臨近組織蔓延。X線會出現點狀、斑狀、片狀甚至大片狀陰影[6]，MP肺炎病變以間質性肺炎多見，肺部病變常累及一肺葉，僅少數成大葉性肺炎改變，而不同影像學表現的支原體肺炎臨床表現有很大差別。

由本組資料可見，相對于MP-支氣管肺炎組，MP-節段性肺炎組具有熱程長、平均住院日長、臨床表現嚴重等特點。目前認為，支原體感染引起肺損傷的機制包括直接侵犯和免疫損傷，前者是病原侵犯、黏附、釋放毒素等直接損傷呼吸道黏膜，后者是因為支原體感染后激發細胞介導的免疫反應，造成肺組織和其他靶器官的損傷[7]。支原體感染的免疫損傷過程包括，機體的免疫清除、免疫紊亂，病原體的免疫逃逸，這些免疫機制的異常都會促進重癥支原體肺炎的發生[8]。

TLR是一類跨膜受體，因其胞外段結構與一種果蠅蛋白Toll同源而得名，是一個重要的模式識別分子受體。在支原體的免疫清除過程中，通過Toll樣受體識別MP膜上的脂蛋白呈遞抗原并激活巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞等固有免疫細胞，將其募集到感染部位并清除[9]。巨噬細胞作為TLR的主要表達者，在清除MP時發揮重要作用。巨噬細胞經其表面TLR,主要是TLR2識別MP特異性抗原后，通過MyD88-NF-κB信號傳導激活，將入侵的MP吞噬后在其溶酶體內殺滅[10]。

本課題既往研究顯示，與健康對照組相比，MP肺炎患兒外周血中TLR-2mRNA、TLR-4mRNA的相對表達量有顯著差異，證實了TLR-2、TLR-4受體參與了支原體在機體感染作用。本實驗進一步表明MP-節段性肺炎組的支原體滴度與MP-支氣管肺炎組相比，有顯著性差異，即隨著支原體滴度的升高，患兒的肺部炎癥更加明顯，臨床癥狀更嚴重。進一步實驗表明，MP-肺炎患兒的TLR-2mRNA的定量與患兒MP的滴度成正相關，分析支原體感染時，隨著支原體滴度的增加，病情的進一步加重，TLR-2在患兒體內的濃度相應增加，參與機體對支原體病原菌清除，提示TLR-2mRNA的定量與患兒的病情嚴重性密切相關。

在感染MP的呼吸系統內，T細胞同時扮演了免疫保護和免疫治病的雙重角色，Cartner等[11]發現，缺失T或B細胞的SCID小鼠和免疫正常的小鼠感染相同數量的MP后，前者肺部的臨床癥狀明顯好于后者，但兩者肺部的MP數量，沒有不同，提示引起支原體肺炎肺部癥狀的主要原因不是病原體本身而是淋巴細胞。

Tim-1和Tim-3是近年發現的T 細胞免疫球蛋白域黏蛋白域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim)基因家族中兩個主要的成員，Tim-1特異表達于Th2細胞表面，其與配體結合后可協同刺激Th2細胞增殖和細胞因子的分泌，說明Tim-1具有調節Th2細胞介導的免疫應答的功能[12]。Tim-3選擇性表達在分化的Th1細胞上，通過與其配體即半乳糖凝集素-9結合,為T細胞提供一種負性共刺激信號，下調Th1的反應[13]。

Th1細胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-β等促炎癥介質為特征，可增強殺傷炎癥細胞的細胞毒性作用，介導細胞免疫應答。Th2細胞可產生IL-4、5、6、10等細胞因子，以抗炎癥介質為主，促進抗體的產生，介導體液免疫應答。如果某些因素引起Th1/Th2失衡，則導致免疫功能紊亂，引起疾病的發生。

本課題既往研究顯示，與健康對照組相比，所有MP-肺炎患兒外周血中Tim-1mRNA的相對表達量有顯著升高，提示Tim-1在支原體感染的急性期發病機制中起一定的作用，Tim-1作為表達在活化后的Th2細胞表面的特征性分子，表達量明顯增加,提示Tim-1在支原體感染的急性期，體內細胞免疫Th1細胞應答受到抑制，以Th2優勢應答為主。

與健康對照和MP-支氣管肺炎兩組相比，MP-節段性支原體肺炎組Tim-1mRNA和Tim-3mRNA的相對表達量明顯升高，提示在支原體感染造成肺部感染明顯、臨床癥狀明顯的MP-節段性肺炎組，Tim-1mRNA和Tim-3均有顯著性升高，特別是針對支原體感染造成的支氣管肺炎組，Tim-3作為Th1型應答的負調節因子，推測可能隨著病情的進一步加重，機體的免疫功能紊亂更明顯，使得支原體病原菌感染的持續化、慢性化、嚴重化。綜上所述，TLR-2、TLR-4和Tim-1、Tim-3參與了不同類型的MP感染的過程，檢測外周血中TLR2、TLR4和Tim1、Tim3的定量有助于判斷患兒肺部感染程度和臨床病情嚴重性，對支原體感染的治療和預后有積極的作用。

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[收稿2015-04-05 修回2015-06-01]

(編輯 許四平)

Expression levels of Tim and TLR gene family and its clinical significance in children with different types of mycoplasma pneumonia

FAN Qing,YAN Ping,LI Pei-Jie.Jinan Municipal Maternity and Child Care Hospital,Ji′nan 250001,China

Objective:To explore expression levels of Tim and TLR gene family in children with different types of mycoplasma pneumonia and their clinical significance.Methods: 56 patients with mycoplasma pneumonia were randomly selected in Ji′nan Maternity and Child Care Hospital from March,2013 to March,2014.All the patients were divided into bronchopneumonia group (n=40) and segmental pneumonia group (n=16) according to their X-ray manifestations.Bronchopneumonia group was characterized as dot,nodular increased density shadow with or without reticular,stripe-like interstitial lesion.Segmental pneumonia was described as segmental or lobar consolidation of lung in X-ray.Meanwhile,30 healthy children were involved in control group with matched age and gender.Peripheral venous blood of all the children in every group was collected and total RNA was extracted.The mRNA of Toll-recepter 2，4 and Tim1，3 was quantified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR),and compared between different groups.Results: The expression of mRNA of TLR-2，4 and Tim1 significantly increases in both bronchopneumonia group and segmental pneumonia group compared to healthy control.Meanwhile,the mRNA of TLR-2，4 and Tim-1，3 was significantly elevated among segmental pneumonia group compared to healthy control.In addition,the gene expression of Tim1，3 was higher in segmental pneumonia group than bronchopneumonia group.Conclusion: The TLR-2，4 and Tim1 gene are over expressed in both types of mycoplasma pneumonia and Tim-1，3 are highly expressed in children with severe infection in lung.The expression alteration of TLR-2,4 and Tim1,3 gene is involved in different types of mycoplasma pneumonia.

Mycoplasma pneumonia;Bronchopneumonia;Segmental pneumonia；Genie expression;qRT-PCR

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.021

樊 青(1971年-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事兒科呼吸學研究。

R725.6

A

1000-484X(2016)04-0546-05

①本文為山東省濟南市衛生科技發展計劃項目(2013-33)。