抑制microRNA-22可通過調節SIRT1表達減輕氧化應激引起的血管內皮細胞損傷

李 陶龐 琪劉永斌

抑制microRNA-22可通過調節SIRT1表達減輕氧化應激引起的血管內皮細胞損傷

李 陶1龐 琪2劉永斌1

目的 探討SIRT1及microRNA-22在氧化應激引起的血管內皮細胞損傷過程中的表達變化和機制。方法 使用20 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導人臍周靜脈血管內皮細胞株（HUVEC）的氧化應激。Cell Tilter Blue細胞活性分析試驗及流式細胞術檢測氧化應激對HUVEC增殖及凋亡的影響。Western blot檢測氧化應激狀態下HUVEC SIRT1蛋白水平的變化，同時qRT-PCR分析氧化應激對HVEC microRNA-22水平的影響。通過轉染microRNA-22 inhibitor抑制HUVEC的microRNA-22表達，并觀察microRNA-22抑制對氧化應激狀態下HUVEC SIRT1表達及細胞增殖的影響。結果 t-BHP誘導的氧化應激可誘導HUVEC的增殖抑制，且降低SIRT1的表達。氧化應激狀態下，HUVEC的microRNA-22表達增高。抑制microRNA-22可以恢復氧化應激狀態下HUVEC的SIRT1表達，減輕細胞增殖抑制。結論 microRNA-22通過調節SIRT1參與氧化應激引起的血管內皮細胞損傷，可作為動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。

動脈粥樣硬化；氧化應激；血管內皮損傷；microRNA；SIRT1

血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）的損傷是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發生發展的中心環節，既是促進AS初期粥樣斑塊形成的使動因素，又是AS惡化的重要原因之一［1-2］。近年來，關于氧化應激和血管內皮損傷關系的研究較為熱門，一般認為氧化應激過程中產生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可導致VEC胞膜凋亡，進而導致血管內皮屏障功能喪失，脂質大量沉積于血管內皮下，形成粥樣斑塊。因此，抗氧化應激保護VEC有助于AS的防治［3-4］。沉默信息調節因子1（Silent mating-type information regulation 2 homolog，SIRT1）是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，參與細胞凋亡的調節并與細胞應激狀態下的存活有關。既往研究認為SIRT1可以維持細胞的存活，具有抗凋亡作用，同時SIRT1是一種對氧化損傷敏感的蛋白［5］。但SIRT1是否在氧化應激造成的VEC損傷中扮演一定角色，還少有報道。microRNA是一類長度約20～24個核苷酸的非編碼RNA，其可通過與靶基因mRNA序列的3'非翻譯區互補，從而降解mRNA來實現對靶基因的轉錄后調控。現有研究證明，microRNA與很多人類疾病相關，包括AS［6］。因此調控microRNA水平，有可能成為治療或緩解動脈粥樣硬化的措施，通過調控microRNA水平來保護AS中的血管內皮損傷具有前景。生物信息學方法證實，microRNA-22可能以SIRT1為靶點。因此，本研究觀察了氧化應激狀態下VEC中SIRT1水平及microRNA-22水平的變化，同時明確了二者以氧化應激所致細胞損傷的關系，現報道如下。

1　材料和方法

1.1細胞培養

HUVEC細胞株培養采用添加10%胎牛血清的DMEM培養基。細胞消化采用0.25%胰酶（含0.02%EDTA的）。培養環境為37℃，5%CO2培養箱。

1.2細胞氧化應激的誘導

參考Khoo等人報道的方法［7］，本研究使用20 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導HUVEC的氧化應激。根據是否使用t-BHP處理，將HUVEC細胞分為兩組，分別為：對照組，即不采用任何刺激處理僅常規培養；t-BHP處理組，使用20 μmol/L t-BHP刺激24 h以模擬氧化應激狀態。

1.3Cell Tilter Blue法分析氧化應激對HVEC增殖的影響

將上述兩組細胞分別接種于96孔板，密度為每孔2×104個細胞。繼續培養12 h、24 h、48 h及72 h，分別于上述時間點，棄去孔內原有液體，每孔加入DMEM稀釋后的Cell Tilter Blue試劑（1：10）72 μL，同時設立空白對照孔（無細胞，僅含Cell Tilter Blue）避光孵育1 h后，使用熒光微板儀讀取各孔熒光強度，并計算細胞存活率。

1.4Western Blot檢測氧化應激對HVEC SIRT1蛋白表達水平的影響

將上述兩組細胞分別接種于6孔板，密度為每孔1×105個細胞。繼續常規培養24 h。收集各組細胞，提取蛋白樣本。使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳并轉膜。轉膜結束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉30 min。采用大鼠源性抗人SIRT1抗體及大鼠源性抗人β-actin孵育膜2 h。TBS-T清洗以除去多余一抗。使用辣根過氧化物酶標記的二抗避光孵育膜2 h，TBS-T清洗以除去多于二抗，滴加ECL發光試劑，顯影曝光，分析蛋白條帶。

1.5qRT-PCR檢測氧化應激對HVEC microRNA-22表達的影響

提取兩組細胞中的總RNA，采用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒將microRNA反轉錄為cDNA，采用上文所述方法，對cDNA進行擴增定量。2-△△CT法計算microRNA-22的相對水平（t-BHP處理組相對于對照組）表示，內參選用U6 RNA。

1.6轉染microRNA 22 inhibitor抑制HUVEC內的microRNA-22表達

將t-BPH處理后的細胞種植于6孔板，密度為每孔1×105個細胞。當細胞匯合度達到70%時進行轉染。轉染采用HiperFect轉染試劑，轉染試劑與miRRNA-22 抑制劑的比例為3：1，miRRNA-22 抑制劑的終濃度為50 nmol/L。轉染miRRNA-22 抑制劑陰性對照序列（microRNA inhibitor NG）作為陰性對照。轉染48 h后，使用qRT-PCR驗證轉染效果，取microRNA-22受到抑制的細胞進行后續試驗。

1.7microRNA-22抑制對氧化應激誘導的HVEC損傷的影響。

收集t-BPH處理+轉染microRNA-22 inhibitor（或microRNA inhibitor NG序列）的HVEC細胞及僅經過t-BPH處理的HVEC細胞，按上文提到的方法，檢測抑制micrRNA-22后，HVEC在氧化應激狀態下的細胞存活情況，同時觀察SIRT1在microRNA 22抑制后的表達變化。

1.8統計學處理

數據的統計學分析采用SPSS 15.0 軟件。計量資料采用（）表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1t-BHP誘導的氧化應激可抑制HVEC細胞的增殖

Cell Tilter Blue分析的結果顯示，在24 h，48 h及72 h時間點，t-BHP處理組細胞的存活率分別為［1.3±0.12），（1.8±0.22）及2.2±0.30］均低于對照組［（1.7±0.1），（2.9±0.2）及（4.3±0.3）］（P＜0.05）（如圖1）。

圖1　t-BHP處理可以抑制HVEC的增殖

2.2t-BHP誘導的氧化應激抑制HVEC細胞SIRT1的表達

Western blot結果顯示（如圖2），t-BHP處理細胞24 h后，SIRT1的蛋白水平較對照組有所降低，提示t-BHP誘導的氧化應激可以抑制SIRT1的表達。

圖2　t-BHP處理可以抑制HVEC SIRT1的蛋白水平

2.3t-BHP誘導的氧化應激增加HVEC細胞microRNA-22的水平

qRT-PCR結果顯示（如圖3），t-BHP處理組細胞的micorRNA-22（1.73±0.24）水平高于對照組（1.00±0.08），差異具有統計學意義（P＜0.05），該結果提示t-BHP誘導的氧化應激可以增加HEVC microRNA-22的表達。

圖3　t-BHP處理可以增加HVEC的microRNA-22水平

2.4抑制microRNA-22可增加氧化應激狀態下HVEC SIRT1的表達并減輕其損傷

抑制microRNA-22可以增加氧化應激狀態下HEVC細胞內的SIRT1表達（如圖4）。同時，抑制microRNA-22還可以保護t-BHP誘導的氧化應激對HVEC的損傷，表現為細胞存活率增加（如圖5）。

圖4　microRNA-22 inhibitor轉染可以增加氧化應激狀態下HVEC的SIRT1蛋白水平

圖5　microRNA-22 inhibitor轉染可以增加氧化應激狀態下HVEC的增殖注：*表示P＜0.05

3　討論

氧化應激是AS發生發展的關鍵環節，伴隨從脂紋形成到粥樣斑塊破裂乃至血栓形成的整個過程［8］。VEC是血管的首道屏障，也是與血液直接接觸的部位，因此是氧化應激損傷的主要目標。ROS對VEC具有直接毒性且作用廣泛能誘發細胞凋亡［9］。除外ROS的直接毒性作用，ROS還可作用于一些細胞信號通路，調節相應基因的表達。如ROS可作用于炎性反應調控通路，誘導腫瘤壞死因子α，白細胞介素-1及干擾素-γ等致炎因子的釋放，從而引起炎性反應。過度激活的炎性細胞又能釋放更多的活性氧物質，從而形成局部惡性循環，加劇對細胞的損傷［10］。ROS還可影響蛋白質的磷酸化，作用于相應的信號通路，實現對細胞生物學行為的調控［11］。此外，ROS還可作用于一些轉錄因子，ROS可通過直接氧化轉錄因子或者影響上級通路蛋白的磷酸化修飾來間接作用于轉錄因子［12］。本研究的焦點之一為AS中氧化應激中產生的ROS對SIRT1表達的影響，以及這種關系對VEC凋亡的影響。SIRT1是sirtuin家族的成員之一，具有組蛋白脫乙酰酶的活性，參與細胞的生長，凋亡調控。一般認為，SIRT1具有抗凋亡作用，是細胞存活的保護因子。在腫瘤中，可檢測到SIRT1的高表達，其可抑制腫瘤細胞的凋亡［13］。近期研究指出，SIRT1可以保護百草枯導致的肺泡上皮細胞損傷［14］。還有研究指出，SIRT1可以緩解心肌缺血再灌注過程中的氧化損傷［15］。SIRT1抑制凋亡的機制之一為SIRT1可以結合P53的乙酰化位點，導致P53去乙酰化失活，而后者是重要的凋亡促進因子［16］。此外SIRT1發揮抗凋亡作用的機制還包括對FOXO轉錄因子的調控［17］。本研究發現在氧化應激狀態下，HVEC的SIRT1表達降低，提示不足的SIRT1表達可能是氧化應激導致VEC損傷凋亡的原因之一。此外，本研究還關注了相關microRNA在氧化應激處理前后的表達變化。使用t-BHP處理后，HVEC的microRNA-22水平增高，且與SIRT1的水平呈反比。更重要的是通過抑制microRNA-22的表達，SIRT1的水平得以恢復，且HVEC的凋亡減少。因此，我們認為氧化應激誘導的HVEC損傷與SIRT1的表達不足有關。下調microRNA-22可通過恢復SIRT1表達抑制氧化應激引起的血管內皮細胞凋亡。

［1］ 李靚，謝巍.我國動脈粥樣硬化基礎研究近三年進展［J］. 中國動脈硬化雜志，2015，23（11）：1182-1188.

［2］ Gray SP，Jandeleit-Dahm KA.The role of NADPH oxidase in vascular disease--hypertension，atherosclerosis & stroke［J］. Curr Pharm Des，2015，21（41）：5933-5944.

［3］ Bo L，Jiang S，Xie Y，et al.Effect of Vitamin E and Omega-3 Fatty Acids on Protecting Ambient PM2.5-Induced Inflammatory Response and Oxidative Stress in Vascular Endothelial Cells［J］. PLoS One，2016，11（3）：e0152216.

［4］ Liu LL，Yan L，Chen YH，et al.A role for diallyltrisulfide in mitochondrial antioxidative stress contributes to its protective effects against vascular endothelial impairment［J］. Eur J Pharmacol，2014，15（725）：23-31.

［5］ Kim H，Lee KH，Park IA，et al.Expression of SIRT1 and apoptosis-related proteins is predictive for lymph node metastasis and disease-free survival in luminal A breast cancer［J］. Virchows Arch，2015，467（5）：563-570.

［6］ 梁斌，蔣曉.MicroRNA在膽固醇逆轉運中的調節作用［J］. 中國動脈硬化雜志，2014，22（2）：196-199.

［7］ Khoo HE，Azlan A，Ismail A，et al.Inhibition of oxidative stress and lipid peroxidation by anthocyanins from defatted Canariumodontophyllum pericarp and peel using in vitro bioassays［J］. PLoS One，2014，9（1）：e81447.

［8］ Bashar T，Akhter N.Study on oxidative stress and antioxidant level in patients of acute myocardial infarction before and after regular treatment［J］. Bangladesh Med Res Counc Bull，2014，40（2）：79-84.

［9］ Chang H，Huang G，Liu L，et al.Protective effects of vitamin E on the vascular endothelial cells from oxidative injury by oxidized lowdensity lipoprotein in vitro［J］. Wei Sheng Yan Jiu，2003，32（6）：576-578.

［10］ Meng N，Zhao J，Su L，et al.A butyrolactone derivative suppressed lipopolysaccharide-induced autophagic injury through inhibiting the autoregulatory loop of p8 and p53 in vascular endothelial cells［J］. Int J Biochem Cell Biol，2012，44（2）：311-319.

［11］ Cao YJ，Zhang YM，Qi JP，et al.Ferulic acid inhibits H2O2-induced oxidative stress and inflammation in rat vascular smooth muscle cells via inhibition of the NADPH oxidase and NF-kappaBpathway［J］. IntImmunopharmacol，2015，28（2）：1018-1025.

［12］ Yun Y，Gao R，Yue H，et al.Synergistic effects of particulate matter（PM10）and SO2 on human non-small cell lung cancer A549 via ROS-mediated NF-kappaB activation［J］. J Environ Sci（China），2015，1（31）：146-153.

［13］ Hu A，Huang JJ，Li RL，et al.Curcumin as therapeutics for the treatment of head and neck squamous cell carcinoma by activating SIRT1［J］. Sci Rep，2015，24（5）： 13429.

［14］ Li S，Zhao G，Chen L，et al.Resveratrol protects mice from paraquat-induced lung injury： The important role of SIRT1 and NRF2 antioxidant pathways［J］. Mol Med Rep，2016，13（2）：1833-1838.

［15］ Ding M，Lei J，Han H，et al.SIRT1 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury via activating eNOS in diabetic rats［J］. CardiovascDiabetol，2015，21（14）： 143.

［16］ Yang H，Yan B，Liao D，et al.Acetylation of HDAC1 and degradation of SIRT1 form a positive feedback loop to regulate p53 acetylation during heat-shock stress［J］. Cell Death Dis，2015，7（6）： e1747.

［17］ Choi HK，Cho KB，Phuong NT，et al.SIRT1-mediated FoxO1 deacetylation is essential for multidrug resistance-associated protein 2 expression in tamoxifen-resistant breast cancer cells［J］. Mol Pharm，2013，10（7）：2517-2527.

Inhibition of microRNA-22 Could Antagonize the Injury Casedby Oxidative Stress in Vascular Endothelial Cells Via Targeting Sirt1

LI Tao1PANG Qi2LIU Yongbin11 Department of Cardiovascular，Lanzhou Petrochemical General Hospital，Lanzhou Gansu 730060，China，2 Department of Respiratory

Objective To investigate the change of SIRT1 and microRNA-22 expression in vascular endothelial cell injury induced by oxidative stress. Methods20 μmol/L t-BHP was used to induce oxidative stress injury. The proliferation and apoptosis of HUVEC under oxidative stress were detected with cell tilter blue assay and flow cytometry. The change of level SIRT1 was determined with Western blot. The level of microRNA-22 in HUVEC under oxidative stress was detected with qRT-PCR assay. The down-regulate of microRNA-22 in HUVEC，microRNA-22 inhibitor was transfected followed with cell tilter blue assay，the effect of microRNA-22 inhibition on HUVEC proliferation was observed. Results The oxidative stress caused by t-BHP could inhibit proliferation of HUVEC. Also，the level of SIRT1 decreased in HUVEC after treated with t-BHP. A high expression of microRNA-22 was observed in HUVEC under oxidative stress. Inhibition of microRNA-22 could recover the expression of SIRT1. Moreover，down-regulation of microRNA-22 could antagonize the proliferation inhibition induced by oxidative stress. Conclusion MicroRNA-22 could play a role in the HUVEC injury caused by oxidative stress via regulate SIRT1. It can be a potential therapy target for atherosclerosis.

Atherosclerosis，Oxitative stress，Vascular endothelial cell injury，MicroRNA，SIRT1

R541

A

1674-9316（2016）21-0023-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.21.014

1蘭州石化總醫院心內科，甘肅 蘭州 730060；2呼吸科 通訊作者：劉永斌，E-mail：liuybres@126.com