雞傳染性喉氣管炎病毒PCR檢測方式的建立和應用

李海利，易秀玲，郎利敏，徐引弟，焦文強，張立憲，張青嫻，游 一，王克領?，李 奎

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002）

雞傳染性喉氣管炎病毒PCR檢測方式的建立和應用

李海利1，易秀玲2，郎利敏1，徐引弟1，焦文強1，張立憲1，張青嫻1，游 一1，王克領1?，李 奎2

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002）

根據GenBank傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）基因序列，設計合成了1對特異性引物。以ILTV DNA為模板，建立了檢測ILTV的PCR檢測方法。通過優化PCR反應條件，成功擴增出一條約690 bp的目的基因片段。而雞傳染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒基因組均未擴增為出相應的片段。敏感性試驗檢測出其DNA最小檢出量為10-2μg。重復性試驗中對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料進行檢測，發現3次重復檢測的結果完全一致。臨床應用中運用上述優化的PCR反應條件進行PCR檢測臨床送檢的16份疑似雞傳染性喉氣管炎病毒感染病料，結果顯示檢出陽性樣品6份，將陽性樣品的PCR擴增產物克隆后序列分析顯示均為雞傳染性喉氣管炎病毒。結果表明，建立的PCR方法具有良好的特異性，敏感性和穩定性，可應用于傳染性喉氣管炎病毒鑒定和臨床診斷。

雞傳染性喉氣管炎病毒；PCR；檢測

雞傳染性喉氣管炎（AILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus， ILTV）引起的一種急性、接觸性上呼吸道傳染病[1-6]，該病傳播快速，自1925年在美國洛島發現該病以來，現已遍及世界各地養雞區域[7-13]。該病的主要病變在喉部和氣管組織，臨床特征為呼吸困難、咳嗽、咳出帶血樣的滲出物[14]。易感雞群一旦感染此病，傳播迅速，感染率達90%以上，病死率平均在10%～20%[15]，蛋雞感染后產蛋量下降，給養雞業造成很大的經濟損失。

該病的臨診癥狀和病理變化易與其他病毒引起的疾病如傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitisvirus， IBV）、新城疫病毒（newcastledisease virus，NDV）等相混淆，容易發生誤診，給臨床診斷帶來一定的困難，因此需要借助實驗室方法加以確診。常規檢測ILT的方法有瓊脂凝膠免疫沉淀法、病原分離鑒定、血清中和試驗和酶聯免疫吸附試驗等，這些方法雖然經典，但缺點是費時且敏感性差，不能檢測亞臨床感染。而PCR技術具有快速、便捷、敏感性和特異性高等特點，目前在病毒檢測方面得到廣泛的應用[16]。因此，本研究利用PCR技術，經過優化反應條件，建立更為快速、特異、敏感的PCR診斷方法，適用于臨床ILTV的檢測和早期診斷，是有效控制該病的發生及傳播的關鍵。

1 材料與方法

1.1 病毒 傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitisvirus，ILTV）、雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus， IBDV）、新城疫病毒（newcastle disease viru，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitisvirus，IBV）、禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV）均由河南省農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑Ex Taq、M-MLV反轉錄酶及其他限制性內切酶、病毒基因組DNA 提取試劑盒、E.Z.N.Z.plasmid miniprep Kit I 質粒提取試劑盒與膠回收試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank中注冊的ILTV的基因序列，設計一對引物，并由上海生物工程有限公司合成。上游引物 5’-CTTCAGACTCCAGCTCATCTG-3’,下 游 引 物 5’-CATCGGGACATTCTCCAGGTAGCA-3’。

1.4 病毒基因組DN ADN A的提取 按照DN A提取試劑盒進行操作，提取的DN A保存在-20℃備用。

1.5 PCRPCR反應

1.5.1 PCR反應條件的優化

1.5.1.1 最適模板用量的確立 分別取1、2、3、4、5、6 μL DN A為模板，進行PCR擴增反應，確定最佳的模板用量。

1.5.1.2 最適引物用量的確立 在50 μL的 PCR反應體系中分別加入不同用量的引物，上、下游引物（20 μm ol/μL）分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.2 μL，進行PCR擴增反應，確定最佳的引物用量。

1.5.1.3 最適退火溫度的確立 PCR反應的退火溫度分別取51、53、55、57和59℃，進行PCR擴增反應，確定最佳的退火溫度。

1.5.2 PCR擴增反應 PCR反應按50 μL體系進行，根據上面試驗確定的最適模板用量為5 μL，最佳的引物用量為1 μL，最佳的退火溫度為55℃，確定PCR的反應體系為Ex Taq（5 U/μL）1 μL，10× Ex Taq Buffer 5 μL，dN TP（2.5 mm ol/L）5 μL， ILTf和 ILTr（20 μm ol/μL）各1 μL，DN A 5 μL，加 DEPC水至50 μL。PCR反應條件是：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。反應結束后取5 μL擴增產物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結果。

1.6 PCRPCR特異性試驗 分別取同體積的ILTV、IB-DV、N DV、IBV、AIV樣品提取基因組DN A（或RN A），用已經建立的方法進行PCR擴增。

1.7 PCRPCR敏感性試驗 將提取的雞傳染性喉氣管炎病毒DN A定量，依次10倍稀釋，使其為10 μg，1 μg，10-1μg，10-2μg，10-3μg，10-4μg，10-5μg，1 pg，10-1pg，10-2pg，10-3pg，10-4pg，10-5pg，10-6pg，10-7pg，10-8pg，10-9pg的DN A含量，在優化后的體系作為模板進行PCR擴增，確定其敏感性。

1.8 PCRPCR重復性試驗 用建立的PCR檢測方法，用建立的PCR檢測方法對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料和3份陰性病料，重復檢測3次，對本方法的重復性和穩定性進行驗證。

1.9 臨床應用 利用建立的PCR檢測方法檢測臨床送檢的疑似病料16份，抽提DN A，按照上述優化反應條件進行PCR檢測，同時設雞傳染性喉氣管炎病毒標準品DN A作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 擴增產物的檢測及鑒定 電泳結果顯示，本PCR體系可擴增出一條約690 bp的ILTV基因片段，擴增的基因片段大小與預期一致（圖1）。

圖1 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR pruducts

2.2 特異性試驗結果 利用試驗設計的引物,該體系以ILTV、IBDV、N DV、IBV、AIV為模板進行PCR擴增，只有ILTV能擴增出690 bp左右的特異性條帶，而其他均未擴增出目的條帶，證明了擴增產物的特異性（圖2）。

2.3 敏感性試驗結果 將模板DN A作l 0倍系列稀釋，取不同稀釋度的模板DN A分別進行PCR擴增，結果10-2μg稀釋濃度的模板仍能擴增出690 bp目的片段，而10-3μg稀釋的模板不能擴增出條帶。說明引物的PCR檢測靈敏度可達10-2μg DN A（圖3）。

2.4 重復性試驗結果 用建立的PCR檢測方法對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料進行檢測，發現3次重復檢測的結果完全一致，說明本次PCR檢測方法的良好的穩定性。

2.5 臨床應用 運用上述優化的PCR擴增反應條件進行PCR檢測臨床送檢的16份疑似雞傳染性喉氣管炎病毒感染病料，結果顯示檢出陽性樣品6份，將陽性樣品的PCR擴增產物克隆后序列分析顯示均為雞傳染性喉氣管炎病毒（圖4）。

3 討論

圖2 PCR特異性試驗結果Fig.2 The specific test results of PCR

圖3 PCR敏感性試驗結果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

圖4 臨床樣品的PCR檢測結果Fig.4 The result of clinical samples detected by PCR

PCR是一個比較復雜的生物化學反應，會受到多種因素的影響[17-25]。首先，引物的選擇是影響PCR成功與否的關鍵因素之一。本試驗根據Gen-Bank公布ILTV基因序列，設計并合成了一對引物，以ILTV DN A為模板通過PCR擴增出一段長690 bp的ILTV目的基因片段，經過測序發現與預期的基因片段一致。該體系又以IBDV、N DV、IBV、AIV為模板進行PCR擴增而均未擴增出目的條帶，證明了擴增產物的特異性。利用優化的PCR反應條件，對其敏感性進行檢測，結果表明，以該對引物建立的PCR檢測方法的最低檢出量達到10-2μg。與傳統檢測方法相比，更加證明了PCR在檢測ILTV上的敏感性，同樣可以用于潛伏感染的ILTV檢測。PCR法除可用于臨床樣品的ILTV檢測和ILTV疾病的診斷外，還可用于檢測疫苗是否有ILTV的污染[26-28]。同時，在臨床應用中，本研究所建立的PCR快速診斷方法，更有利于對雞傳染性喉氣管炎病毒的流行病學調查、臨床檢測和疾病早期診斷。

目前，診斷ILTV主要用瓊脂凝膠免疫沉淀法（AGID）、免疫熒光（FA）、病毒分離（VI）、血清中和試驗（SN）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。但這些方法都比較繁瑣，敏感性或特異性較差[29]。該PCR檢測體系以感染組織的DN A為模板，不須提純病毒。而且PCR分析對樣品的要求不嚴格，對于采樣不及時或樣品保存時間較長，對檢測結果影響均較小[30]，可在數小時內完成檢測工作。綜上所述，PCR檢測方法因其簡單迅速，敏感性和特異性高的特點，將在當前檢測技術中發揮更加重要的作用。

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Establishment and Application of Polymerase Chain Reaction for Infectious Laryngotracheitis Virus

Li Hai li1,Yi Xiuling2,Lang Li min1,Xu Yindi1,Jiao Wenqiang1,Zhang Lixian1, Zhang Qingxian1,You Yi1,Wang Keling1*,Li Kui2
(1. Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, HenanZhengzhou 450002;2. College of animal husbandry and medical engineering, Henan Agricultural University, Henan Zhengzhou450002)

According to the gene sequence of Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV) that publishedin GenBank, the experiment designed and synthesized a pair of specific primers. Using thegenomic DNA of ILTV as a template, a PCR method was established for the detection of ILTV gene.By optimizing PCR reaction conditions, a 690 bp fragment was amplified from the genome of ILTV,but not from IBDV, NDV , IBV and AIV. The sensitivity test showed that the minimum detectableamount of its DNA was 10- 2 μg. The Repeatability test detected3 copies of testing positive forInfectious Laryngotracheitis Virus and showed the same results. Using the optimized PCR reactionconditions in the clinical application for detecting 16 samples which were Suspected that infect-IBedwith Infectious Laryngotracheitis Virus, the testing results showed 6 positive samples. Afteringcloning and analyzing sequence of the positive samples’PCR amplification product, it showedthat all infected with Infectious Laryngotracheitis Virus. The results indicated that the PCRmethod has good specificity, sensitivity and stability, and can be used for the detection of ILTV.

Infectious Laryngotracheitis Virus; PCR; Detection

2.65

B

1672-9692(2016)03-0001-07

2016-01-20

李海利（1982-），男，河南省開封人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

王克領（1964-），男，河南柘城人，本科，副研究員，主要從事獸醫傳染病防控研究工作。

河南省農業科學院自主創新基金。