RNA干擾沉默STC-1基因對結腸癌細胞株HCT116增殖的影響

訾永宏， 李小寶， 陳紅梅

(1延安大學附屬醫院普外科，延安 716000；2延安職業技術學院醫學系；*通訊作者，E-mail：ziyonghong2016@163.com)

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RNA干擾沉默STC-1基因對結腸癌細胞株HCT116增殖的影響

訾永宏1*， 李小寶1， 陳紅梅2

(1延安大學附屬醫院普外科，延安 716000；2延安職業技術學院醫學系；*通訊作者，E-mail：ziyonghong2016@163.com)

目的 探討RNA干擾技術沉默STC-1基因對結腸癌細胞株HCT116增殖的影響。 方法 將STC-1基因的si-RNA穩定轉染至HCT116細胞；采用RT-PCR、Western blot鑒定干擾效果；以STC-1基因沉默細胞HCT116為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為陰性對照和空白對照組，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法、細胞倍增時間、平板克隆形成實驗、流式細胞術等分析沉默STC-1基因后，HCT116細胞生長速度、細胞周期、克隆形成能力等的改變。 結果 MTT實驗結果表明，沉默STC-1基因后，實驗組細胞的生長速度明顯下降；其細胞周期也發生改變G1期細胞增多、S期細胞減少。空白對照組、陰性對照組和實驗組細胞平均倍增時間為分別為(3.718±0.82)h,(3.981±0.918)h,(5.018±0.981)h；空白對照組，陰性對照組和實驗組平均細胞克隆形成數目分別為65.68±4.826,71.28±4.662,45.95±4.432。實驗組與對照組相比較，平均倍增時間和平均細胞克隆形成數目差異有統計學意義(P<0.05)。 結論 沉默 STC-1基因對結腸癌細胞HCT116的增殖具有重要的作用，這為進一步闡明結直腸癌發病機制奠定了堅實的基礎。

RNA干擾； STC-1； 結腸癌； HCT116

斯鈣素-1(stanniocalcin-1,STC-1)是一類先后在硬骨魚、哺乳動物和人類中發現的糖蛋白激素，在調節鈣、磷代謝，促進腦神經元的終末分化以及骨和肌肉的發育等方面都有重要作用[1,2]。近來研究發現，STC-1在人類腫瘤的發生發展過程中也起著十分重要的作用[3]。越來越多的研究表明，STC-1在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織[4,5]。本實驗前期也發現STC-1在結腸癌細胞株HCT116中高表達，但其對結腸癌發生過程中的作用目前還不十分清楚。因此，本實驗擬進一步探討STC-1對結腸癌細胞株HCT-116生物學表型的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

HCT116細胞由中南大學細胞中心保存，RPMI-1640培養基購自Gibico公司(美國)，新生小牛血清購自Biology Industries公司(以色列)，胰蛋白酶購自研科生物試劑公司，pGCsi/U6/GFP/si-STC-1購自上海吉凱基因有限公司，轉染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購自上海英維捷基貿易有限公司，MTT、G418、DMSO購自鼎國生物技術有限公司，細胞培養板購自Corning公司(美國)，Giemsa染料、碘化丙啶(PI)購自Sigma公司(美國)。離心機( 湖南長沙平凡離心機廠，中國)，酶標儀(Bio-TK公司產品，美國)，細胞培養箱(Thermor公司產品，美國)，顯微鏡(Olympus公司產品，日本)。

1.2 pGC/U6/GFP/si-STC-1重組載體構建

從基因Bank中提取STC-1基因 (序列號：NM_003155)，設計3條STC-1的干擾序列：①5′-TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA-3′;②5′-TAGATTGCTGCAAATTTCATG-3′;③5′-ACAAGGTAGTCAGCCAAGCAC-3′，由上海吉凱基因公司設計、合成干擾片段并定向克隆入pGCsi/U6/GFP載體，并以空載體pGCsi/U6/GFP(Mock)為對照。

1.3 細胞轉染

將待轉染細胞HCT116用培養基稀釋至1×105cells/ml，接種于24孔板，培養過夜；待其密度至80%左右，將2 μl脂質體2000加入48 μl無血清RPMI 1640培養基中輕輕混勻，37 ℃孵育5 min，分別加入1 μg重組質粒pGC/U6/GFP/si-STC-1和1 μg對照質粒pGC/U6/GFP(Mock)至49 μl RPMI-1640無血清培養基中輕輕混勻，室溫孵育5 min；將上述兩種混合液，輕輕混勻，溫箱中至少孵育20 min；D-Hank’s液洗1次，加入2 ml無抗生素的完全RPMI 1640培養基，再加入含有重組質粒的混合溶液，輕輕混勻，置于37 ℃培養箱中培養4-6 h；棄上清并換新鮮的RPMI 1640完全培養基37 ℃培養24-48 h，棄上清并傳代，加入含400 μg/ml G418的培養基篩選陽性克隆。

1.4 RT-PCR鑒定干擾效果

總RNA抽提及RT-PCR按產品說明書進行。逆轉錄按FERMENTAS公司的試劑盒說明書操作。逆轉錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，反應終止后冰上冷卻，-20 ℃保存。PCR條件：95 ℃ 1 min預變性；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 90 s，循環30次；68 ℃延伸10 min。擴增產物用溴乙淀染色，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其中人STC-1引物為：sense 5′-TTCTGGTGCTGGTGATCAGTG-3′，antisense 5′-TTTGGGCACAGTGGTCTGTCT-3′，產物大小為594 bp。GAPDH sense 5′- AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，antisense 5′-CCTGCTTCACCACCTTCT TG -3′，產物大小為580 bp。

1.5 Western blot鑒定干擾效果

細胞蛋白質抽提按產品說明書進行。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠濃度為10%、濃縮膠濃度為5%；上樣時各取50 μg蛋白樣品，加入5%的巰基乙醇，100 ℃變性5 min；電泳開始為恒壓60 V，當樣品進入分離膠后，把電壓提高到100 V，電泳至溴酚蘭剛跑到玻璃邊緣時終止電泳，轉膜。轉膜完成后，將轉印后的NC膜置含5%的脫脂奶粉的封閉液中，4 ℃封閉過夜。封閉后的NC膜經PBST洗板3次，每次5 min，加入含1∶400的鼠抗人STC-1的一抗，于搖床上室溫反應2 h，將膜取出PBST洗3次， 每次5 min，加1∶3 000稀釋的兔抗鼠IgG-HRP酶標二抗，于搖床上室溫下避光反應1 h；PBST洗板3次，每次 5 min，暗室曝光、顯影、定影，最后將其曝光結果掃描。

1.6 MTT法測定細胞生長曲線

以STC-1基因沉默組的HCT116細胞為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組，每組細胞均按5×103/孔接種于96孔培養板，加高糖DMEM培養液(含20%小牛血清，無抗生素)，置37 ℃、5% CO2，培養24 h貼壁后，每孔再加入MTT至終濃度為5 g/L，繼續培養4 h，棄培養液，加入DMSO 200 μl，待藍紫色結晶顆粒充分溶解后于490 nm處測OD值，每組設6個復孔，實驗連續6 d，實驗重復3次。然后以OD值為縱軸，時間為橫軸繪制細胞生長曲線，比較實驗組與對照組細胞的生長速度。

1.7 細胞倍增時間測定

以STC-1基因沉默的HCT116細胞為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組，每組細胞均取對數生長期細胞消化后重懸并臺盼藍染色計數活細胞，按103/孔接種于24孔板，培養24 h，用胰酶消化并進行細胞計數，每組均設4個平行孔，實驗連續5 d，實驗重復3次。計算每組細胞的平均倍增時間。倍增時間公式如下：TD=t[lg2/(lgNt-lgN0)](TD為細胞倍增時間；t為培養時間；N0，Nt分別代表接種后及培養t小時后的細胞數)。

1.8 平板克隆形成能力測定

以STC-1基因沉默的HCT116細胞為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為陰性對照和空白對照組。取對數生長期細胞，胰酶消化后用含10%小牛血清的DMEM培養基重懸并用臺盼染色計數活細胞，接種6孔細胞培養板，每孔加入100個細胞, 置37 ℃、5% CO2培養2-3周；棄上清液，PBS洗板2次，甲醇固定15 min；加Giemsa染色15 min，然后用水緩慢洗去染色液，空氣干燥；顯微鏡下計數克隆數，細胞數大于50個的計數為1個克隆數。每個濃度組細胞均設3個平行樣，每個實驗重復3次，計算平均克隆形成數。

1.9 細胞周期的測定

以STC-1基因沉默的HCT116細胞為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞和空白的HCT116細胞為對照組，每組細胞均取對數生長期細胞5×103接種于培養瓶，待貼壁后，用無血清培養基洗滌2次，再用無血清培養基繼續培養24 h，用胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗2次，PI染色30 min。300目尼龍網過濾后，上流式細胞儀分析，并按以下公式計算其增殖指數(proliferative index,PI):PI=(G2M+S)/(G0/1+S+G2M)×100%。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 HCT116/si-STC-1、HCT116/si-M細胞系的構建

分別將重組質粒HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-①、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-②、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-③和對照質粒pGC/U6/GFP用脂質體轉染HCT116細胞，經400 μg/ml G418篩選約2周，挑單克隆擴大培養(見圖1A，B)，采用RT-PCR分別檢測HCT116，HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-①、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-②、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-③和HCT116/pGC/U6/GFP細胞中的STC-1 mRNA表達水平，結果顯示，在HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-①細胞中未檢測到STC-1 mRNA的表達，而在HCT116、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-②、HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-③和HCT116/pGC/U6/GFP細胞的STC-1 mRNA水平變化不明顯，分別將HCT116/pGC/U6/GFP/si-STC-1-①和HCT116/pGC/U6/GFP細胞系命名為HCT116/si-STC-1和HCT116/si-M(見圖1C)。進一步采用Western blot實驗分別檢測HCT116，HCT116/si-STC-1和HCT116/si-M細胞中STC-1蛋白的表達水平，結果顯示，HCT116/si-STC-1細胞中未檢測到STC-1蛋白的表達(見圖1D)，這一結果與RT-PCR檢測結果相一致。這說明成功建立沉默STC-1的細胞系，可用于后續實驗。

圖1 穩定轉染pGC/U6/GFP/si-STC-1和pGC/U6/GFP的實驗結果Figure 1 Results of cells with stable transfection pGC/U6/GFP/si-STC-1and pGC/U6/GFP

2.2 細胞生長曲線

以STC-1基因沉默的HCT116細胞(HCT116/si-STC-1)為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細胞為對照組，用MTT實驗檢測其生長速度。結果表明，與對照組相比，實驗組細胞HCT116/si-STC-1的生長速度明顯下降(見圖2)。

圖2 MTT法檢測STC-1沉默組細胞和對照組細胞的生長曲線Figure 2 Cell proliferation curve of HCT116 cells with or without STC-1 knockdown detected by MTT assay

2.3 細胞倍增時間

以STC-1基因沉默的HCT116細胞(HCT116/si-STC-1)為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細胞為對照組，檢測其生長速度。結果發現，HCT116、HCT116/si-M、HCT116/si-STC-1細胞平均倍增時間為分別為(3.718±0.82)h、(3.981±0.918)h、(5.018±0.981) h。與對照組細胞相比，沉默STC-1基因后，實驗組細胞平均倍增時間明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3)。

與其他兩組比較，*P<0.05圖3 沉默STC-1基因后HCT116細胞的平均倍增時間 Figure 3 The cells double time of HCT116 with or without STC-1 knockdown

2.4 克隆形成能力

以STC-1基因沉默的HCT116細胞(HCT116/si-STC-1)為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細胞為對照組，用平板克隆形成檢測其克隆形成能力。結果顯示：HCT116、HCT116/si-M、HCT116/si-STC-1細胞克隆形成數目分別為65.68±4.826，71.28±4.662，45.95±4.432。與對照組細胞相比，沉默STC-1基因后，實驗組HCT116細胞的克隆形成能力明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

與其他兩組比較，*P<0.05 B.STC-1沉默后HCT116細胞的克隆形成率 圖4 平板克隆形成實驗結果 Figure 4 Results of colony formation of HCT116 Cells

2.5 細胞周期的分布

以STC-1基因沉默的HCT116細胞(HCT116/si-STC-1)為實驗組，以轉染空質粒的HCT116細胞(HCT116/si-M)和空白的HCT116細胞為對照組，用流式細胞儀檢測其細胞周期的分布。結果表明，實驗組HCT116/si-STC-1細胞與對照組細胞HCT116、HCT116/si-M相比，實驗組細胞HCT116/si-STC-1 G1期細胞增多，S期細胞減少(見圖5)，其結果與細胞生長曲線，平板克隆形成實驗結果趨勢相一致。

圖5 STC-1基因沉默后HCT116細胞周期檢測Figure 5 Cells cycle of HCT116 with or without STC-1 knockdown

3 討論

STC-1是一種糖蛋白激素,以旁分泌或自分泌方式參與機體的多種生理功能。人類STC-1基因位于染色體8(8p11.2-p21的)的短臂，STC-1的cDNA 編碼一個含247個氨基酸的蛋白質。近來研究發現,STC-1與腫瘤的關系密切，STC-1不同程度地過表達于肺癌[6]、肝癌[7]和甲狀腺癌[8]等多種腫瘤組織，并參與胃癌[9]、乳腺癌[10]及腎癌[11]的發生、發展。但目前國內外有關STC-1與結腸癌的關系的研究報道很少。

STC-1在結腸癌組織中存在過表達[4,5]，在結腸癌細胞株HCT116中高表達，本研究利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)特異地抑制結腸癌細胞HTC116中STC-1基因的表達后，MTT、細胞倍增時間、平板克隆形成實驗、流式細胞術實驗顯示對STC-1的抑制顯著地抑制了結腸癌細胞HTC116的增殖，因此STC-1可能在結腸癌發生發展中扮演著重要角色。STC-1介導腫瘤細胞增殖的作用機制尚不明確。STC-1 在多種腫瘤中可能通過不同途徑參與腫瘤形成。Yeung等[12]研究發現STC-1具有誘導腫瘤適應低氧環境的作用，其中內源性缺氧誘導因子(HIF)-1是關鍵因子。STC-1 在腎癌細胞中促進腫瘤增殖，其機制可能是HIF-1 調控STC-1 的表達，促進腫瘤生長[13]。Murai等[10]研究顯示，在乳腺癌中，STC-1促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移是通過活化PI3K途徑來發揮作用。關于STC-1在結腸癌中作用機制的研究是我們下一步研究的目標。

綜上所述，干擾STC-1 基因表達可明顯地引起細胞周期阻滯，繼而導致細胞增殖能力和惡性程度的降低，提示STC-1 在結腸癌的發生發展中起著重要的作用，為以STC-1為靶點的結腸癌的診斷及治療提供理論依據及靶向策略。

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Effect of RNA interference-mediated STC-1 silencing on proliferation of colon cancer cell line HCT116

ZI Yonghong1*, LI Xiaobao1, CHEN Hongmei2

(1DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofMedicine,Yan’anVocationalandTechnicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:ziyonghong2016@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of RNA interference-mediated STC-1 gene silencing on the proliferation of colon cancer cell line HCT116.MethodsColon cancer cell line HCT116 was transfected by STC-1 small interfering RNA(siRNA), and the expression of STC-1 was determined by RT-PCR and Western blot. HCT116 cells with STC-1 knockdown were chosen as experimental group, and HCT116 cells transfected with empty plasmid and blank HCT116 cells were chosen as negative and blank control groups. Then the proliferation of HCT116 was examined by MTT assay, the cell doubling time of HCT116 was examined by doubling time assay, the colony formation ability of HCT116 was examined by colony formation assay, and the cell cycle of HCT116 was examined by flow cytometry.ResultsCompared with control groups,the growth ability in experimental group was significantly decreased and G1phase cells increased and S phase cells decreased. The doubling time was(3.718±0.82)h,(3.981±0.918)h, (5.018±0.981)h in blank control group, negative control group and experimental group, respectively.The colony numbers were 65.68±4.826, 71.28±4.662, 45.95±4.432 in blank control group, negative control group and experimental group，respectively. The doubling time and colony numbers were significantly different between control groups and experimental group(P<0.05).ConclusionSTC-1 gene may play an important role in proliferation of colon cancer cell line HCT116,which lay a solid foundation for further study of the pathogenesis of colorectal cancer.Key words: RNA interference; STC-1; colon cancer; HCT116

陜西省教育廳科研計劃基金資助項目(12JK0765)

訾永宏，男，1979-02生，本科，主治醫師，E-mail:ziyonghong2016@163.com

2016-06-23

R735.35

A

1007-6611(2016)11-0973-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.003