青磚茶清除DPPH·能力及其多酚和黃酮含量研究

楊新河，呂幫玉，黃明軍，4，斯琴朝克圖，毛清黎，劉仲華，*

（1.湖北工程學院生命科學技術(shù)學院，湖北孝感432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北孝感432000；3.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感432000；4.湖北大學生命科學學院，湖北武漢430062）

青磚茶清除DPPH·能力及其多酚和黃酮含量研究

楊新河1，2，3，呂幫玉1，2，黃明軍1，2，4，斯琴朝克圖1，2，毛清黎1，2，劉仲華1，2，*

（1.湖北工程學院生命科學技術(shù)學院，湖北孝感432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北孝感432000；3.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感432000；4.湖北大學生命科學學院，湖北武漢430062）

采用DPPH自由基（DPPH·）清除法測定了18個青磚茶樣品的抗氧化活性，并按照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》方法和亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法分別測定它們的多酚和黃酮含量。結(jié)果表明：18個青磚茶水提取物均能清除DPPH·，具有抗氧化活性，它們的濃度（0.05mg/mL～0.30mg/mL）與DPPH·清除率之間具有良好的線性關(guān)系，二者的相關(guān)系數(shù)介于0.9742～0.9945，且清除DPPH·的IC50最大值為0.2586mg/mL，最小值為0.1144mg/mL；多酚和黃酮含量的最高值分別為3.57%和3.84%，最低值分別為2.06%和1.01%；青磚茶清除DPPH·的IC50與多酚和黃酮含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.684和0.715。

青磚茶；DPPH自由基；多酚；黃酮

青磚茶以老青茶為原料，經(jīng)渥堆、壓制定型、烘房干燥等工序加工而成，屬于西北高寒高脂飲食地區(qū)人們的生活必需品。其品質(zhì)特征為色澤青褐、內(nèi)質(zhì)香氣純正無青氣、滋味純正、湯色深黃紅稍亮、葉底暗褐呈豬肝色。由于黑茶對糖脂代謝性疾病具有良好的保健效果[1-7]，成為當今茶葉消費的新熱點，而青磚茶作為黑茶家族的主要成員和湖北特有的黑茶，迎來了很好的發(fā)展機遇。

伴隨著自由基生物醫(yī)學的快速發(fā)展和廣大公眾健康意識的不斷提高，自由基與多種疾病的關(guān)系已愈來愈被重視，積極探尋高效低毒的自由基清除劑—天然抗氧化劑成為生物化學和醫(yī)藥學的研究熱點。而抗氧化作用被認為是茶保健抗癌作用最重要的機制。關(guān)于茶的抗氧化作用研究集中在紅茶、綠茶、烏龍茶和普洱茶，且茶多酚及其衍生產(chǎn)物被認為它們抗氧化作用的特征成分，然而青磚茶的體外抗氧化作用幾乎未被研究。本研究采用常用的體外DPPH自由基（DPPH·）清除法評價來源與年份不同的18個青磚茶的抗氧化活性，并按照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》方法和亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法分別測定它們的多酚和黃酮含量，以期初步探明青磚茶抗氧化活性能力及其與多酚和黃酮含量的相關(guān)性，為青磚茶的進一步研究與綜合加工利用提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗采用的青磚茶成品樣分別來源于湖北省趙李橋茶廠有限責任公司、湖北省羊樓洞生態(tài)茶業(yè)有限公司、湖北洞莊茶廠和湖南永巨茶業(yè)有限公司，共計18個青磚茶樣品編號Q1～Q18。

1.2 試劑

1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；福林酚試劑、沒食子酸、蘆丁、VC、碳酸鈉、甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等：購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器

752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；AL104電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）公司；DT5-2型低速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；101A-3型數(shù)顯鼓風干燥箱：上海新諾儀器設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.4 方法

1.4.1 青磚茶提取液的制備

稱取已干燥的2 g（準確至0.001 g）磨碎試樣于500mL錐形瓶中，加沸蒸餾水300mL，立即移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min搖動一次）。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，濾液定容至500mL，備用。

1.4.2 青磚茶清除DPPH·能力測定

參照文獻[8]，分別取不同濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL）青磚茶提取液2mL于試管中，加入2mL 2×10-4mol/LDPPH溶液（無水乙醇配制），混合均勻，室溫下暗處靜置30min后，以2mL水與2mL無水乙醇的混合液調(diào)零點在波長518 nm處測定其吸光度A1，以2mL水代替提取液與2mLDPPH溶液混合反應后測定其吸光度A0，以2mL提取液與2mL無水乙醇混合液測定其吸光度A2，以消除提取液本身的影響。以維生素C作為清除DPPH·的陽性對照品。按以下公式計算不同濃度青磚茶提取液對DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]×100，求出青磚茶濃度與DPPH·清除率的線性回歸方程，然后計算得到青磚茶清除DPPH·的IC50。

1.4.3 青磚茶中多酚含量測定

按照GB/T 8313-2008方法進行。以沒食子酸為標準物，經(jīng)測定計算得到標準曲線方程為Y=0.011 1X-0.002 1，r=0.998 8，式中：Y為吸光值；X為多酚濃度，μg/mL。稱取干燥的茶樣品0.2000g（精確到0.0001g），放入10mL離心管中，加入70℃預熱的5mL 70%甲醇溶液，渦旋混勻后于70℃水浴鍋中浸提10min，以每2 min攪拌1次，浸提完畢冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10min，過濾得到濾液，濾渣按照上述方法再浸提1次，過濾，合并兩次濾液并用70%甲醇定容至10mL，搖勻后于24 h內(nèi)測定多酚濃度，經(jīng)計算得到樣品中多酚含量。

1.4.4 青磚茶中黃酮含量測定

按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法方法進行。以蘆丁為標準物，經(jīng)測定計算得到標準曲線方程為Y=1.062 4X+ 0.035 7，r=0.999 4，式中：Y為吸光值；X為黃酮質(zhì)量，mg。稱取干燥的茶樣品0.5 g（精確到0.000 1 g），放入10mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇5mL，在室溫下用超聲波振蕩浸提20min，將提取液過濾至25mL容量瓶中，濾渣按照上述方法重復浸提兩次過濾，合并濾液后用70%乙醇定容至25mL。接著取濾液0.5mL于容量瓶中，加入4.5mL蒸餾水至體積為5mL，加入0.3mL 10%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6min；加0.3mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min；加4mL 4%氫氧化鈉

溶液，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15min。在510nm處測定吸光值代入標準曲線方程得到0.5mL濾液中黃酮質(zhì)量，經(jīng)計算得到樣品中黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青磚茶水提取物清除DPPH·能力

青磚茶水提取物清除DPPH·能力的測定結(jié)果見表1。

表1 青磚茶水提取物清除DPPH·能力Tab le1 Scavenging capacity ofwater extractof Qingzhuan brick tea on DPPH free radical

由表1可知，青磚茶各樣品水提取物能清除DPPH·，并且它們的濃度介于0.05mg/mL～0.30mg/mL時，清除DPPH·能力隨著濃度的增加而增強，與DPPH·清除率呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，二者的相關(guān)系數(shù)介于0.974 2～0.994 5。青磚茶樣品的水提取物對DPPH·清除率以Q5樣品的IC500.114 4mg/mL最小，以Q13樣品的IC500.258 6mg/mL最大，均大于陽性對照品VC的IC500.011 1mg/mL，但清除DPPH·的IC50與其生產(chǎn)單位及年份之間無明顯的關(guān)聯(lián)性。

2.2 青磚茶中多酚與黃酮含量

茶多酚為一類含有多酚羥基的化學物質(zhì)，能清除體內(nèi)活性自由基，具有很強的抗氧化作用，在食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應用前景。青磚茶中多酚含量的測定結(jié)果見圖1。

圖1 青磚茶中多酚含量Fig.1 Contentsof polyphenolsof Qingzhuan brick tea

由圖1可知，多酚含量以青磚茶樣品Q9中最高，為3.57%；樣品Q15中的最低，為2.06%。

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，以其廣譜的藥理作用引人矚目，也是茶葉中的主要功效成分。青磚茶中黃酮含量的測定結(jié)果見圖2。

圖2 青磚茶中黃酮含量Fig.2 Contentsof flavonoidsof Qingzhuan brick tea

由圖2可知，黃酮含量以青磚茶樣品Q9中最高，為3.84%；樣品Q1中最低，為1.01%。

從圖1和圖2還可知，同一生產(chǎn)單位青磚茶中多酚和黃酮含量與其年份并沒有直接的關(guān)系；同一年份不同生產(chǎn)單位的青磚茶中多酚和黃酮含量均不同。

2.3 青磚茶清除DPPH·的IC50與多酚和黃酮含量的關(guān)系

對青磚茶清除DPPH·的IC50與其多酚含量進行統(tǒng)計分析表明，青磚茶清除DPPH·的IC50Y（mg/mL）與其多酚含量X（%）的相關(guān)性見圖3所示。

圖3 青磚茶清除DPPH·的IC50與其多酚含量的相關(guān)性Fig.3 Correlation of scavenging DPPH·with IC50and polyphenols contentsof Qingzhuan brick tea

由圖3可知，二者的線性回歸方程為Y=-0.056 8X+ 0.305 5，相關(guān)系數(shù)（r）=0.684，提示青磚茶清除DPPH·的IC50與其多酚含量之間具有相關(guān)性。

對青磚茶清除DPPH·的IC50與其黃酮含量進行統(tǒng)計分析表明，青磚茶清除DPPH·的IC50Y（mg/mL）與其黃酮含量X（%）的相關(guān)性見圖4所示。

圖4 青磚茶清除DPPH·的IC50與其黃酮含量的相關(guān)性Fig.4 Correlation of scavenging DPPH·with IC50and flavonoids contentsof Qingzhuan brick tea

由圖4可知，二者的線性回歸方程為Y=-0.0347X+ 0.233 6，相關(guān)系數(shù)（r）=0.715，提示青磚茶清除DPPH·的IC50與其黃酮含量之間具有相關(guān)性，且略高于青磚茶清除DPPH·的IC50與其多酚含量的相關(guān)性。

3 討論

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應的作用。根據(jù)在DPPH溶液中加入自由基清除劑使穩(wěn)定的有機DPPH·的單電子配對，在DPPH·強吸收波長517 nm處的吸光度變小，顏色變淺，且這種顏色的變淺程度與配對電子數(shù)成劑量關(guān)系[9]。因此，可通過測定波長517 nm處的吸光度來評價自由基被清除的情況，從而評價試驗樣品的抗氧化能力。DPPH法有穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點[10-11]。DPPH法已在全世界范圍內(nèi)被廣泛用于自由基清除能力的定量分析[12]。本研究表明，青磚茶各樣品水提取物具有抗氧化作用，對DPPH·有一定的清除作用。這與陳玉瓊等[6]研究表明青磚茶能增強機體抗氧化能力相一致。

近年來，多酚類和黃酮類物質(zhì)成為人們關(guān)注的熱點。本研究進行了18個青磚茶樣品中多酚和黃酮含量的檢測，結(jié)果表明，青磚茶中多酚的平均含量介于2.06%～3.57%，而羅堃等采用Folin-Ciocalteu比色法測定3批安化黑茶中茶多酚的平均含量為2.49%[13]，說明同屬于黑茶類，且對原料老嫩要求及加工關(guān)鍵工序渥堆相同的青磚茶與安化黑茶中茶多酚含量較接近；青磚茶中黃酮的平均含量介于1.01%～3.84%，均高于侯冬巖報道的陳年8年熟普洱中黃酮類化合物的含量[14]。此外，經(jīng)過進一步測定發(fā)現(xiàn)，青磚茶各樣品的含梗量、碳水化合物含量、水浸出含量等指標及感官評審等方面存在差異，有待提升并落實青磚茶種植、采摘、加工等環(huán)節(jié)的標準。

多酚類物質(zhì)是抗氧化性物質(zhì)中最大的一類，普遍存在于植物界。關(guān)于多酚含量與抗氧化能力之間的關(guān)系已有兩種截然不同的觀點：Yang等認為二者之間存在顯著的相關(guān)性[15]，而Ismail等認為二者之間沒有相關(guān)性[16]。而本研究結(jié)果表明，青磚茶中多酚含量與清除DPPH·的IC50之間具有一定的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.684，提示多酚對青磚茶清除DPPH·發(fā)揮了積極的作用。另外，黃酮類物質(zhì)是預防型和阻斷型抗氧化劑。張紅雨等用AMI方法對若干黃酮類抗氧化劑做了計算，發(fā)現(xiàn)黃酮化合物鄰二酚羥基清除自由基的活性強于間二酚羥基，總結(jié)解釋出B環(huán)酚羥基活性高的規(guī)律[17]，而青磚茶中黃酮含量與清除DPPH·的IC50之間呈現(xiàn)出相關(guān)性，且相關(guān)系數(shù)達到0.715。因此，青磚茶中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與清除DPPH·的關(guān)系有待進一步研究。

4 結(jié)論

青磚茶各樣品水提取物濃度（0.05mg/mL～0.30mg/ mL）與DPPH·清除率之間具有良好的線性關(guān)系，二者的相關(guān)系數(shù)（r）介于0.974 2～0.994 5，且清除DPPH·的IC50在0.114 4mg/mL～0.258 6mg/mL之間；青磚茶中多酚和黃酮含量分別介于3.57%～2.06%和3.84%～1.01%之間，且青磚茶清除DPPH·的IC50與多酚和黃酮含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.684和0.715；青磚茶具有作為天然抗氧化劑和功能性食品開發(fā)的潛力。

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Studies on DPPH Free Radical Scavenging Capacity and Polyphenols and Flavonoids Contents of Qingzhuan Brick Tea

YANGXin-he1，2，3，LüBang-yu1，2，HUANGMing-jun1，2，4，SIQinchaoketu1，2，MAOQing-li1，2，LIU Zhong-hua1，2，*
（1.Schoolof Life Scienceand Technology，HubeiEngineering University，Xiaogan 432000，Hubei，China；2.HubeiProvincialResearch Centerof Engineering Technology for Utilization ofBotanical Functional Ingredients，Xiaogan 432000，Hubei，China；3.HubeiKey Laboratory ofQuality ControlofCharacteristic Ftuitsand Vegetables，Xiaogan 432000，Hubei，China；4.College of Life Science，HubeiUniversity，Wuhan 430062，Hubei，China）

DPPH method was used to determine the antioxidant activities of eighteen samples of Qingzhuan brick tea.According to the GB/T 8313-2008 method and Sodium nitrite-aluminum nitrate colorimetric method，contents of polyphenols and flavonoids of Qingzhuan brick teawere determined.Resultsshowed thatwaterextractsofallsamplesexhibited theantioxidant activity，a good linear relationship with the correlation coefficient ranging from 0.974 2 to 0.994 5 was existed between their concentrations ranging from 0.05mg/mL to 0.30mg/mL and DPPH free radical scavenging ratio，and the IC50maximum and minimum values of DPPH free radical scavenging capacity for Qingzhuan brick tea were 0.258 6mg/mL and 0.114 4mg/mL.Polyphenols contentwas between 3.57%and 2.06%，and flavonoids content between 3.84%and 1.01%.Correlation coefficient of scavenging DPPH·with IC50and contents of polyphenolsand flavonoidswere0.684 and 0.715，respectively.

Qingzhuanbrick tea；DPPH free radical；polyphenols；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.001

2016-02-18

國家自然科學基金資助項目（31370692；31370691）；湖北省自然科學基金面上項目（2014CFB573）

楊新河（1974—），男（漢），副教授，博士，研究方向：茶及功能食品化學。

*通信作者：劉仲華（1965—），男（漢），教授，博士，研究方向：茶及功能食品化學。