臍橙皮中黃酮的超聲波輔助雙水相提取工藝研究

汪建紅，匡晨

（1.內江師范學院化學化工學院，四川內江641112；2.四川省高等學校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，四川內江641112）

臍橙皮中黃酮的超聲波輔助雙水相提取工藝研究

汪建紅1，2，匡晨1

（1.內江師范學院化學化工學院，四川內江641112；2.四川省高等學校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，四川內江641112）

以低溫烘干的臍橙皮為原料，利用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取臍橙皮中的黃酮。通過單因素試驗和正交試驗，考察了乙醇濃度、硫酸銨用量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間、液料比、回流提取溫度、回流提取時間等因素對黃酮提取效果的影響。結果表明，最適宜的提取條件為：乙醇濃度40%，硫酸銨用量8 g，超聲波處理溫度50℃，超聲波處理時間50min，液料比25∶1（mL/g），回流提取溫度60℃，回流提取時間3 h。在此條件下做了4次平行試驗，平均得率可達8.173%，遠高于相同條件下超聲波非雙水相法、雙水相非超聲波法和非超聲波非雙水相法，而且試驗重現性好。

臍橙皮；黃酮；雙水相；超聲波；提取

臍橙是一種美味可口、營養豐富的水果，因其獨特的口味，深受人們喜愛，也催生了臍橙加工產業的蓬勃發展[1-2]。但在生產加工和食用過程中，臍橙皮往往作為垃圾被直接拋棄，既污染了環境，又浪費了資源。臍橙皮中含有豐富的生物活性成分，特別是黃酮[3]。黃酮具有消炎、抗菌、抗氧化、抗癌等生物活性，引起了

很多人的關注[4-5]。

黃酮類化合物常用的提取方法有有機溶劑法[6]、酶法[7-8]、微波法[9]、超臨界法[10]、超聲波輔助法[11-12]、雙水相法[13-14]等。有機溶劑法操作簡便，但條件較為苛刻、黃酮得率較低，且還可能使用有毒溶劑。酶法操作條件溫和，得率也較高，但酶易失活。微波法時間短，提取效率較高，但微波可能會破壞黃酮分子結構和給人體帶來負面影響。超臨界法得率較高，但設備復雜，成本較高。超聲波輔助法條件溫和，快速高效。雙水相法是一種新的提取方法，操作簡便，條件溫和，提取效率較高，且提取物活性損失小，且后處理容易。因此，本文綜合超聲波法和雙水相法的優點，選擇超聲波輔助雙水相法提取臍橙皮中的黃酮。

常用的雙水相體系較多，乙醇-硫酸銨雙水相體系分相容易，且避免了高分子雙水相體系黏度大、難處理的缺點，也不使用有毒有害溶劑[15]。因此本文選擇超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取臍橙皮中的黃酮，并優化其提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DFT-100型100克手提式高速萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHB-B95型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；FA2204A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；CS101-2AB型電熱鼓風干燥箱：中華人民共和國重慶試驗設備廠；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海興創科學儀器有限公司；722N型可見分光光度計：上海菁華科技儀器公司；759S型紫外-可見分光光度計：上海棱光技術有限公司。

臍橙皮：購自重慶奉節；蘆丁標準品為優級純；無水乙醇、硫酸銨、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

測定波長的選擇：參照文獻方法[13]以30%的乙醇為溶劑配制0.20mg/mL的蘆丁標準溶液，然后準確移取1.00mL于帶刻度試管中，加入顯色劑顯色，在300 nm～600 nm范圍內利用紫外-可見分光光度計進行掃描，發現510 nm處出現強吸收峰，因此選擇510 nm為測定波長。

標準曲線的繪制：參照文獻方法[13]，利用上述0.20 mg/mL的蘆丁標準溶液分別配制0.008、0.016、 0.024、0.032、0.040、0.048 mg/mL的蘆丁標準溶液，并分別先后加入5%的亞硝酸鈉溶液、10%的硝酸鋁溶液、4%的氫氧化鈉溶液顯色，在510 nm波長位置測吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 黃酮的提取與測定

稱取2.00 g臍橙皮粉于250mL圓底燒瓶中，按照設定的液料比（V乙醇溶液：m臍橙皮粉）、乙醇濃度和硫酸銨用量加入乙醇溶液和硫酸銨固體，先按照設定的超聲波功率、處理溫度、處理時間處理，再移去超聲波按照設定的回流溫度，回流提取一定時間，過濾，將濾液在容量瓶中稀釋至100mL，放置備用[13]。

參照文獻方法[13]，準確移取1.0mL上述提取液于100mL容量瓶中，用30%乙醇溶液定容；再從中準確移取1.00mL于50mL容量瓶中，定容；從中取出1.00mL樣品溶液于25mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.00mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液6.00 mL，搖勻，放置15min，再在510 nm處測其吸光度值，根據標準曲線回歸方程，得到被檢測的提取液濃度。總黃酮得率按照下式計算：Et/%=（C×V×n）/W× 100，式中Et為得率，%；C為測得的提取液濃度，g/mL；n為稀釋倍數，W為原料的質量，g；V為測得的提取液體積，mL。

1.2.3 乙醇濃度對黃酮得率的影響

在硫酸銨用量、液料比、超聲波功率、超聲波處理溫度、超聲波處理時間、回流提取溫度、回流提取時間分別為8 g、10∶1（mL/g）、160W、40℃、20min、40℃、2 h的條件下，選擇不同乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%），重復1.2.2的操作。

1.2.4 硫酸銨用量對黃酮得率的影響

在1.2.3確定的乙醇濃度，和液料比、超聲波功率、超聲波處理溫度、超聲波處理時間、回流提取溫度、回流提取時間分別為10∶1（mL/g）、160W、40℃、20min、40℃、2 h的條件下，選擇不同硫酸銨用量（6、8、10、12、14 g），重復1.2.2的操作。

1.2.5 超聲波處理溫度對黃酮得率的影響

在1.2.3和1.2.4確定的乙醇濃度和硫酸銨用量，及液料比、超聲波功率、超聲波處理時間、回流提取溫度、回流提取時間分別為10∶1（mL/g）、400W、20min、40℃、2 h的條件下，選擇不同超聲波處理溫度（30、40、50、60、70℃），重復1.2.2的操作。

1.2.6 超聲波處理時間對黃酮得率的影響

在1.2.3、1.2.4和1.2.5確定的乙醇濃度、硫酸銨用

量、超聲波處理溫度，及液料比、超聲波功率、回流提取溫度、回流提取時間分別為10∶1（mL/g）、400W、40℃、2 h的條件下，選擇不同超聲波處理時間（20、30、40、50min），重復1.2.2的操作。

1.2.7 液料比對黃酮得率的影響

在1.2.3、1.2.4、1.2.5和1.2.6確定的乙醇濃度、硫酸銨用量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間，及超聲波功率、回流提取溫度、回流提取時間分別為400W、40℃、2 h的條件下，選擇不同液料比即V乙醇溶液：m臍橙皮粉（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）），重復1.2.2的操作。

1.2.8 回流提取溫度對黃酮得率的影響

在1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6和1.2.7確定的乙醇濃度、硫酸銨用量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間、液料比，及超聲波功率、回流提取時間分別為400W、2 h的條件下，選擇不同回流提取溫度（30、40、50、60、70℃）下，重復1.2.2的操作。

1.2.9 回流提取時間對黃酮得率的影響

在1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6、1.2.7和1.2.8確定的乙醇濃度、硫酸銨用量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間、液料比、回流提取溫度及超聲波功率為400W的條件下，選擇回流提取時間（1、2、3、4、5 h），重復1.2.2的操作。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。

圖1 標準曲線Fig.1 The standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

乙醇體積濃度對臍橙皮中黃酮提取效果的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Effectsof theethanolconcentration on yield of flavonoid

從圖2可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮得率呈先增加后減少的趨勢；當達到40%時，黃酮得率達最大值。這是由于黃酮在乙醇中溶解度遠大于水中，乙醇濃度的增加也導致雙水相上層乙醇濃度的增加，因此有利于黃酮的溶解浸出；但乙醇濃度過大時也會增加脂溶性雜質的浸出，反過來抑制黃酮的提取，綜合考慮，選擇最佳乙醇濃度40%。

2.2.2 硫酸銨用量對黃酮得率的影響

硫酸銨用量的影響如圖3所示。

圖3 硫酸銨用量對黃酮得率的影響Fig.3 Effectsof theamountof ammonium sulfateon yield of flavonoid

從圖3可知，在6 g～10 g范圍內，黃酮得率隨硫酸銨用量的增加而增加，當硫酸銨用量達到10 g時，達最大值，此后隨著硫酸銨用量的增加，黃酮得率逐漸下降。這是由于硫酸銨用量的增加增強了雙水相體系的分相能力，導致體系上層乙醇濃度增加，有利于黃酮的浸出，但硫酸銨用量過大時，雙水相體系穩定性遭到破壞，會有較多晶體析出，同時上層乙醇濃度增加也會導致脂溶性雜質析出的增加，抑制黃酮的提取。因此綜合考慮，選擇最佳硫酸銨用量10 g。

2.2.3 超聲波處理溫度對黃酮得率的影響

超聲波處理溫度的影響如圖4所示。

圖4 超聲波處理溫度對黃酮得率的影響Fig.4 Effectsof theultrasonic treatm ent temperatureon yield of flavonoid

從圖4可看到，隨超聲波處理溫度的增加，黃酮得率呈先增加后減少的趨勢；當溫度達到50℃時，得率達最大值。這是由于超聲波處理溫度越高，超聲波對臍橙皮組織的破壁能力越強，越有利于黃酮的浸出，但過高的溫度也會導致被超聲波分解變質的黃酮的量增加。綜合考慮節能和得率，選擇最佳超聲波處理溫度50℃。

2.2.4 超聲波處理時間對黃酮得率的影響

超聲波處理時間的影響如圖5所示。

圖5 超聲波處理時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effectsof theultrasonic treatment timeon yield of flavonoid

從圖5可知，隨著超聲波處理時間的延長，黃酮得率先增加后減少，當達到30min時，得率達最大值。這是由于時間越長，超聲波對臍橙皮組織的破壁程度越大，越有利于黃酮的浸出，但處理時間過長時，被超聲波破壞的黃酮的量也逐漸增加。綜合考慮，選擇最佳超聲波處理時間為30min。

2.2.5 液料比對黃酮得率的影響

液料比即V乙醇溶液：m臍橙皮粉對黃酮提取效果的影響如圖6所示。

從圖6可知，隨著溶劑用量的增加，黃酮得率先逐漸增加，后又逐漸下降，當液料比達到20∶1（mL/g）時，得率達最大值。這是由于溶劑越多，能溶解的黃酮越多，越有利于黃酮的浸出，但溶劑量的增加也增加了浸出的脂溶性雜質的量，抑制了黃酮的提取，也是對試劑的一種浪費。綜合考慮，選擇最佳液料比為20∶1（mL/g）。

圖6 液料比對黃酮得率的影響Fig.6 Effectsof the liquid-solid ratio on yield of flavonoid

2.2.6 回流提取溫度對黃酮得率的影響

回流提取溫度對黃酮提取效果的影響如圖7所示。

圖7 回流提取溫度對黃酮得率的影響Fig.7 Effectsof the reflux extraction temperatureon yield of flavonoid

從圖7可知隨著回流提取溫度的上升，黃酮得率呈現先上升后下降的趨勢，回流提取溫度60℃時為黃酮得率的峰值位置。這是由于隨著回流提取溫度的上升，黃酮分子變得更活躍，更有利于進入溶劑，但過高的回流提取溫度也會增加被氧化變質的黃酮的量。綜合考慮選擇60℃為最佳回流提取溫度。

2.2.7 回流提取時間對黃酮得率的影響

回流提取時間對黃酮提取效果的影響如圖8所示。

從圖8可看到，隨著回流提取時間的延長，黃酮得率逐漸增加，當3 h時達最大值，此后隨回流提取時間的繼續延長，黃酮得率卻呈逐漸下降的趨勢。這是由于開始時溶劑中的黃酮濃度較小，遠未達到飽和；當回流提取時間達到3 h時，溶劑中黃酮量接近于飽和，繼續延長時間不但不會浸出更多的黃酮，還會導致被氧化變質的黃酮的量的增加。綜合考慮，選擇最佳回

流提取時間為3 h。

圖8 回流提取時間對黃酮得率的影響Fig.8 Effectsof the refluxing extraction timeon yield of flavonoid

2.3 正交試驗

參照單因素試驗的結果，在超聲波功率、回流提取溫度、回流提取時間分別為400W、60℃、3 h的前提下，以乙醇濃度、硫酸銨質量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間和液料比，5個因素為考察因素，每個因素選取4個水平，設計了L16（45）正交表來安排試驗，每組試驗條件作了3次平行試驗，其結果如表1和表2所示。

表1 L16（45）正交試驗設計及結果Table1 L16（45）orthogonalexperimentaldesign and results

表2 正交試驗結果方差分析Table2 Varianceanalysisof theorthogonalexperiment results

從表1可看出，臍橙皮中黃酮的得率受到了乙醇濃度、硫酸銨質量、超聲波處理溫度、超聲波處理時間和液料比5個因素的交叉影響，各影響的主次次序為液料比>超聲波處理時間>乙醇濃度>超聲波處理溫度>硫酸銨用量。最佳水平組合為A2B2C4D3E2，即：乙醇濃度40%，超聲波處理溫度50℃，超聲波處理時間50min，液料比25∶1（mL/g），硫酸銨用量8 g。

為了進一步確定試驗因子的可信度，對臍橙皮中黃酮得率的正交試驗結果的方差分析見表2。從表2可看到，在臍橙皮黃酮所選擇提取工藝的正交試驗所選取的因素和水平范圍內，因素C和D即超聲波處理時間和液料比達到了顯著水平，而因素A、B、E即乙醇濃度、超聲波處理溫度、硫酸銨用量對臍橙皮中黃酮提取的影響不顯著。而F值結果表明，方差分析結果與直觀的極差分析結果一致。

對正交試驗結果進行4次平行試驗驗證，結果臍橙皮中黃酮得率分別為8.121%、8.207%、8.087%、8.276%，平均值為8.173%，說明了正交試驗結果的正確性。

2.4 幾種提取方法的比較

表3列舉了相同條件下幾種提取方法提取臍橙皮中黃酮的情況。

表3 幾種提取方法下的黃酮提取情況Table3 Theextraction effectsof flavonoid by severalkindsof extractingmethods

從表3可知超聲波輔助雙水相的方法獲得的黃酮得率遠大于其它幾種方法，因此聲波輔助雙水相提取黃酮確實是一種很有發展前途的提取方法。

3 結論

本文通過設計單因素試驗和正交試驗，得出了提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度40%，超聲波功率400W，超聲波處理溫度50℃，超聲波處理時間50min，液料比25∶1（mL/g），硫酸銨用量8 g，回流提取時間3 h，回流提取溫度60℃。通過平行試驗的驗證可知，該方法不但得率較高，而且試驗重現性好，也說明正交試驗得出的結論是正確的。同其他方法相比，超聲波輔助雙水相提取法具有操作簡便，得率高，分離容易等優點。該研究結果對臍橙皮中黃酮的進一步開發利用提供了理論基礎。

[1]欒進華,向曉軍,劉東,等.奉節臍橙產區不同表生環境土壤有益元素特征分析[J].安徽農業科學,2011,39(36):22623-22624

[2]劉世堯.奉節臍橙黃酮類特征性成分HPLC色譜指紋圖譜構建與應用[J].中國農業科學,2013,46(19):4131-4148

[3]焦士蓉,黃承鈺.柑橘屬類黃酮生物活性的研究進展[J].西華大學學報(自然科學版),2008,27(1):32-35

[4]蘇東林,單楊,李高陽.紫外分光光度法測定柑桔皮中總黃酮的含量[J].食品研究與開發,2007,28(8):126-128

[5]張玉,曾凡坤,吳劍.響應面法優化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝[J].食品科學,2010,31(8):28-32

[6]董宇.黃酮類化合物的提取方法研究與展望[J].人參研究,2009 (4):33-35

[7]王巖巖,李明,周伊玲,等.纖維素酶提取刺山柑黃酮及抗氧化性研究[J].食品工業,2015(3):1-3

[8] 張勝幫,葉靜,陳聰.復合酶法提取荷葉黃酮類化合物工藝優化[J].食品科學,2012(12):149-153

[9]楊娟霞,董偉,韓林磊,等.響應面法優化微波法提取甘青青蘭總黃酮工藝[J].食品工業科技,2015(1):216-219

[10]曲文娟,王然然,劉書元,等.不同方法萃取蜂膠的黃酮含量及地區化差異[J].食品與發酵工業,2014(5):246-251

[11]曹穩根,段紅,翟科峰,等.超聲波法提取豆腐柴根總黃酮的工藝[J].光譜實驗室,2014(1):38-42

[12]張玉,曾凡坤,吳劍.微波輔助提取柑橘皮渣中類黃酮的研究[J].食品工業科技,2010,31(7):210-212

[13]汪建紅,廖立敏,王碧.乙醇-硫酸銨雙水相體系提取檸檬渣中總黃酮研究[J].華中師范大學學報(自然科學版),2013(1):78-81

[14]何慧蓉,黃藝,鄧選利,等.雙水相-微波提取苧麻皮中總黃酮及抗氧化性研究[J].天然產物研究與開發,2014(8):1299-1302

[15]鄭尚季,賈玉榮,秦崢,等.雙水相體系萃取白英總皂苷[J].沈陽藥科大學學報,2012,29(4):302-306

Study on Extraction Technological of Flavonoid in Navel Orange Peel by Ultrasonic-assisted Aqueous Two-phase System

WANG Jian-hong1，2，KUANGChen1
（1.College ofChemistry and Chemical Engineering，Neijiang NormalUniversity，Neijiang 641112，Sichuan，China；2.Key Laboratory of FruitWaste Treatmentand Resource Recycling，Neijiang641112，Sichuan，China）

With low-temperature baked navel orange peel as raw materials，the flavonoid in navel orange peel was extracted by ultrasonic-assisted aqueous two-phase system of ethanol-（NH4）2SO4.The effectofethanol concentration，amountof ammonium sulfate，ultrasonic treatment temperature，ultrasonic treatment time，the liquid-solid ratio，reflux extracting temperature，and reflux extracting time，on the extraction rate of the flavonoid，were studied by the single factor experiments and the orthogonal tests.The result showed that the mostsuitable extracting conditionswere，the ethanol concentration of40%，the amountof the ammonium sulfate of8 g，the ultrasonic treatment temperature of50℃，the ultrasonic treatment time of 50min，the liquidsolid ratioof25∶1（mL/g），the reflux extracting temperatureof60℃，and the reflux extracting timeof3 h.Under the optimal conditions，four parallel experimentswere carried out，and the average extraction rate could reach 8.173%，whichwashighlymore than the yield by ultrasonic and no aqueous two-phase system，by aqueous two-phase system and no ultrasonic，and by no ultrasonic and no aqueous two-phase system at the same conditions.The reproducibilityof theexperimentswasgood.

navelorange peel；flavonoid；aqueous two-phase system；ultrasonic；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.013

2016-03-06

四川省教育廳重點項目（15ZA0291）；內江師范學院校級項目（14ZB01）

汪建紅（1981—），男（漢），高級實驗師，碩士，主要從事天然產物的提取、純化及性質等方面的研究。