藤本豆豆莢總黃酮提取及抗氧化活性研究

曹柏營，戚穎欣，姜秀娟，昌友權

（吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林長春130052）

藤本豆豆莢總黃酮提取及抗氧化活性研究

曹柏營，戚穎欣，姜秀娟，昌友權

（吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林長春130052）

利用響應面法優化藤本豆豆莢總黃酮提取工藝并進行體外抗氧化活性的評價。通過單因素試驗選定提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度為考查因素，利用Box-Behnken進行試驗設計，回歸和方差分析結果顯示，回歸模型極顯著（p<0.000 1），試驗方法可信度較高。藤本豆豆莢總黃酮提取的最佳工藝如下：時間5 h，溫度90℃，液料比1∶20（g/ mL），乙醇濃度60%。在此條件下藤本豆豆莢總黃酮的得率為6.42%。藤本豆豆莢總黃酮對ABTS+·（IC50=87.86μg/mL）和DPPH自由基（IC50=71.91μg/mL）具有一定的清除作用，對Fe3+具有較好的還原能力（相關系數R2=0.994），藤本豆豆莢總黃酮表現一定的體外抗氧化活性。

藤本豆豆莢；黃酮類化合物；響應面法；抗氧化活性

藤本豆是利用野生扁豆與大油豆雜交獲得的豆科植物新品種，藤本豆中含有豐富的蛋白質、氨基酸和黃酮類化合物[1]。研究表明，藤本豆中的蛋白、多糖和多肽具有調節免疫、降低血清膽固醇和抗腫瘤的功效[2-3]，藤本豆中的黃酮類化合物具有一定的抗氧化活性，且與大豆的抗氧化活性呈顯著差異（p<0.05）[4]。藤本豆豆莢是藤本豆加工過程中的廢棄物，產量很大，一般作焚燒處理，另據報道植物豆莢中的黃酮類化合物含量比較豐富[5-9]。黃酮類化合物已報道了多種生物活性，如調節免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等[10-14]。藤本豆豆莢中黃酮類化合物的開發，可以改善生態環境，變廢為寶，提高藤本豆的附加值。因此，本論文以藤本豆豆莢為原料提取總黃酮，對其抗氧化活性進行評價，為藤本豆資源的綜合利用及新資源食品的開發提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藤本豆豆莢采自福建省永春縣岵山鎮藤本豆種植示范基地，采后自然晾干，臨用時烘箱（60℃）干燥、粉碎、過篩（80目）備用。

1.2 試劑

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：sigma；ABTS [2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽]：am－

resco；蘆丁標準品：中國藥品生物制品鑒定所；硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鐵、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸均為分析純。

1.3 儀器

UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；WFJ2100可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；PL203電子天平：上海梅特勒-托利多儀器公司；雷磁ZD-2自動電位滴定儀：上海雷磁有限公司；H.H. KW-1000DC數顯電熱恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；FW177中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE52-99旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的繪制參照鄭媛媛的方法[15]。線性回歸得到標準曲線方程為：y=6.179x+0.011（R2=0.996）。蘆丁標樣濃度在0.001 6mg/mL～0.019 2mg/mL范圍內，蘆丁濃度與吸光度呈線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

1.4.2 藤本豆豆莢總黃酮得率的測定

藤本豆豆莢總黃酮得率測定方法參照1.4.1。根據標準曲線計算藤本豆豆莢總黃酮得率。

式中：A為吸光度值；M為稱取樣品質量，g。

1.4.3 藤本豆豆莢總黃酮提取工藝優化

單因素試驗分別考查溫度、料液比、時間、乙醇濃度和pH值對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響，選取影響得率的主要因素，即時間、溫度、料液比和乙醇濃度為考查變量，以總黃酮得率為響應值，進行 Box-Behnken試驗設計。試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素水平編碼表Table1 The factorsand levelsof RSM

1.4.4 藤本豆豆莢總黃酮的純化

選用AB-8樹脂對藤本豆豆莢總黃酮粗提物進行純化，處理后的樹脂裝入層析柱（5 cm×60 cm），上樣流速為2BV/h，60%（體積分數）乙醇水溶液為洗脫劑，流速為2BV/h。純化后凍干備用。

1.4.5 藤本豆豆莢總黃酮的體外抗氧化活性測定

1.4.5.1 ABTS+·清除能力測定

參照陳飛[16]的試驗方法。

1.4.5.2 DPPH·清除能力的測定

參照劉香萍[17]的試驗方法。

1.4.5.3 Fe3+還原能力的測定

參照儲維維[18]的試驗方法。

1.5 數據處理

所有試驗數據均以X±SD表達，方差分析采用SPSS（19.0）軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響

提取溫度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響Fig.2 Theeffectsof extraction temperatureon yield of FPLH

由圖2可知，隨著提取溫度的升高，藤本豆豆莢總黃酮的得率逐漸增加，提取溫度達到90℃時藤本豆豆莢總黃酮得率達到6.61%，此后溫度升高，藤本豆豆莢總黃酮得率降低。溫度過高可能破壞黃酮類化合物的結構，影響得率。

2.1.2 料液比對藤本豆豆莢黃酮得率的影響

料液比對藤本豆豆莢黃酮得率的影響見圖3。

圖3可知，隨料液比的增大，藤本豆豆莢總黃酮得率先增加后減少，當料液比為1∶20（g/mL）時藤本豆豆莢總黃酮得率達到最大為5.47%。

2.1.3 提取時間對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響

提取時間對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響見圖4。

圖3 料液比對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響Fig.3 Theeffectsof ratio of liquid to solid on yield of FPLH

圖4 提取時間對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響Fig.4 Theeffectsofextraction timeon yield of FPLH

由圖4可知，隨著提取時間的延長，藤本豆豆莢總黃酮的得率逐漸增加，當達到6 h以后出現下降趨勢，提取時間為5 h藤本豆豆莢總黃酮得率達到最大為5.64%。

2.1.4 乙醇濃度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響

乙醇濃度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響Fig.5 Theeffectsof ethanolconcentration on yield of FPLH

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增大，藤本豆豆莢總黃酮得率先增大后減小，當乙醇濃度為60%時藤本豆豆莢總黃酮得率達到最大為5.78%。

2.1.5 pH值對藤本豆豆莢總黃酮提取率的影響

pH值對藤本豆豆莢總黃酮提取率的影響見圖6。

圖6 pH值對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響Fig.6 Theeffectsof pH valueon yield of FPLH

由圖6可知，pH值增大藤本豆豆莢總黃酮的含量有所增加，當pH值為9時黃酮的得率最大為5.54%，但藤本豆豆莢總黃酮得率的變化率較小，pH值對藤本豆豆莢總黃酮得率的影響較小，工藝優化過程中未考慮pH值的影響。

2.2 響應面試驗方案及結果

2.2.1 試驗方案及結果分析

利用Design Expert 8.0軟件進行回歸和方差分析，建立數學模型，獲得藤本豆豆莢總黃酮提取最佳工藝，試驗方案及結果見表2。

表2 試驗方案及試驗結果Table2 Design and resultsof tests

續表2 試驗方案及試驗結果Continue table2 Design and resultsof tests

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗[17]

利用多項擬合回歸，得到藤本豆豆莢總黃酮得率對提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度的二次多項回歸模型為：Y=6.288-0.026 667X1+0.121 67X2+ 0.019 167X3-0.015 833X4+0.147 5X1X2-0.11X1X3-0.132 5X1X4-0.172 5X2X3+0.15X2X4-0.025X3X4-0.404 42X12-0.466 92X22-0.495 67X32-0.363 17X42。方差分析結果見表3。

表3 回歸模型分析Table3 Theanalysisof regressionm odel

由表3可見，回歸方程模型極顯著（p＜0.000 1），試驗方法可信度較高；一次項X2差異顯著（p＜0.05）；交互項X2X3差異顯著（p＜0.05），二次項X12、X22、X32、X42差異極顯著（p＜0.01），試驗因素與響應值之間的關系不是簡單的線性關系。試驗因素對藤本豆豆莢總黃酮得率影響順序為：時間＞溫度＞料液比＞乙醇濃度。

2.2.3 最優工藝條件求取與驗證

Design Expert8.0軟件分析得到的最優提取工藝如下：時間5.3 h，溫度90℃，料液比1∶20.3（g/mL），乙醇濃度59.5%；藤本豆豆莢總黃酮得率的理論值可達到6.53%。修正后藤本豆豆莢總黃酮提取最優工藝如下：時間5 h，溫度90℃，料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度60%。在最優工藝下重復提取藤本豆豆莢總黃酮5次進行驗證，得到的藤本豆豆莢總黃酮的平均得率為6.42%，與理論值吻合較好。

2.3 藤本豆豆莢總黃酮純化

提取制備的藤本豆豆莢總黃酮經AB-8大孔吸附樹脂純化后，總黃酮純度達到35.73%。

2.4 藤本豆豆莢總黃酮體外抗氧化活性測定結果

2.4.1 藤本豆豆莢總黃酮對ABTS+·清除能力

藤本豆豆莢總黃酮對ABTS+·清除率的影響見圖7。

圖7 藤本豆豆莢總黃酮對ABTS+·的清除作用Fig.7 ABTS+radicalscavenging ability of FPLH

由圖7可見，在不同質量濃度時，藤本豆豆莢總黃酮對ABTS自由基的清除率（IC50=87.86μg/mL）弱于VC（IC50=33.99μg/mL），但藤本豆豆莢總黃酮濃度在10μg/mL～160μg/mL內對ABTS自由基清除率逐漸增大，超過160μg/mL后，對ABTS+·的清除率增加不明顯，黃酮濃度為200μg/mL時清除率最大為84.26%，對ABTS+·的清除能力與四齒四棱草總黃酮相同[18]。

2.4.2 藤本豆豆莢總黃酮對DPPH·清除能力

藤本豆豆莢總黃酮對DPPH自由基清除率的影響見圖8。

由圖8可見，在不同濃度時，藤本豆豆莢總黃酮對DPPH自由基的清除率（IC50=71.91μg/mL）弱于VC（IC50=32.01μg/mL），但藤本豆豆莢總黃酮濃度在10μg/mL～140μg/mL內對DPPH自由基清除率逐漸增大，超過140μg/mL后，對DPPH·的清除率增加不顯

著，總黃酮濃度為200μg/mL時清除率最大為91.24%，DPPH·清除能力與內蒙紫草總黃酮相同[19]。

圖8 藤本豆豆莢總黃酮對DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH radicalscavenging ability of FPLH

2.4.3 藤本豆豆莢總黃酮的還原能力

藤本豆豆莢總黃酮的還原力見圖9。

圖9 藤本豆豆莢總黃酮的還原力Fig.9 The reducing power of FPLH

由圖9可見，在不同質量濃度時，藤本豆豆莢總黃酮的還原力逐漸增強（吸光度增大），試驗結果經線性回歸，其相關系數R2=0.994。但藤本豆豆莢總黃酮的還原力弱于VC，這與藤本豆黃酮的還原力相同[4]。

3 結論

通過單因素和Box-Behnken試驗設計優化了藤本豆豆莢總黃酮提取的最優工藝，回歸和方差分析結果表明，模型方程極顯著（p＜0.000 1），各試驗因素對總黃酮得率影響的順序為：時間＞溫度＞料液比＞乙醇濃度。藤本豆豆莢總黃酮最佳提取工藝如下：時間5 h，溫度90℃，液料比1∶20（g/mL），乙醇濃度60%。5次驗證試驗的總黃酮平均得率為6.42%，與預測值基本吻合。

體外抗氧化試驗結果表明，藤本豆豆莢總黃酮濃度在10μg/mL～160μg/mL內對ABTS+·清除率逐漸增大，至200μg/mL時清除率最大為84.26%；藤本豆豆莢總黃酮黃酮濃度在10μg/mL～140μg/mL內對DPPH自由基清除率逐漸增大，至200μg/mL時清除率最大為91.24%；藤本豆豆莢總黃酮對Fe3+具有一定的還原能力，線性回歸的相關系數R2=0.994。藤本豆豆莢總黃酮表現一定的體外抗氧化活性。藤本豆豆莢總黃酮的進一步分離純化及動物體內抗氧化活性的評價是課題下一步研究的重點。

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Study on Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Perennial lablab sp.Hull

CAOBai-ying，QIYing-xin，JIANGXiu-juan，CHANGYou-quan
（Food Engineering College of Jilin Engineering NormalUniversity，Changchun 130052，Jilin，China）

The response surfacemethodologywasutilized to optimize extraction processof total flavonoids from Perennial lablab sp.hull（FPLH）and its antioxidantactivitywere studied.Through single experiments，extraction time，extraction temperature，ratio of liquid to solid and ethanol concentration were selected for Box-Behnken central composite designing．The results of regression and ANOVA revealed that the regressionmodel for total flavonoids yield exhibited tremendous significance（p<0.000 1）.The optimal extraction processwere time5 hours，temperature 90℃，ratio of liquid to solid 1∶20（g/mL）and ethanol concentration 60%.The yield of FPLH was up to 6.42%.The antioxidant tests results indicated that scavenging capacity（IC50）of total flavonoids towardsABTS+·and DPPH·were87.86μg/mLand 71.91μg/mL，respectively.FPLH showed strong reducing power towards Fe3+（R2=0.994）.FPLH showed strongantioxidantactivity in vitro.

Perennial lablab sp.hull；flavonoids；response surfacemethodology；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.014

2016-08-09

吉林省教育廳十二五科技規劃項目（吉教科合字2013第369號）

曹柏營（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：天然產物研究與開發。