高壓脈沖電場輔助提取葛花黃酮工藝優化

代名君，尤麗新，文連奎，*，殷涌光

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.長春科技學院生物食品學院，吉林長春130600；3.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130022）

高壓脈沖電場輔助提取葛花黃酮工藝優化

代名君1，尤麗新2，文連奎1，*，殷涌光3

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.長春科技學院生物食品學院，吉林長春130600；3.吉林大學生物與農業工程學院，吉林長春130022）

以乙醇為溶劑，采用高壓脈沖電場輔助提取葛花黃酮，以黃酮得率為指標，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法考察乙醇濃度、料液比、電場強度、脈沖數對葛花黃酮得率的影響并確定最佳工藝條件。試驗結果表明：乙醇濃度60%，料液比1∶32（g/mL），電場強度16 kV/cm，脈沖數8個，此時黃酮得率為10.373%。

高壓脈沖電場；提?。桓鸹ǎ稽S酮

葛花（Pueraria lobata）為豆科植物葛的干花蕾，又名葛條花，是我國的傳統藥物[1]。葛花性味甘涼，含有黃酮類、皂苷類、甾醇類、香豆素類以及生物堿類等活性成分，并含有多種無機元素及揮發油成分。研究表明，葛花具有解酒醒脾[2]，降血糖降血脂[3-4]、改善學習記憶等功效[5-6]。葛花中的黃酮類、皂苷類等有效成分具有良好的生理活性[7]，在免疫系統及內分泌系統中發揮協調作用，可有效改善因酒精引起的新陳代謝異常等情況。

傳統工藝對葛花黃酮的提取方法有：有機溶劑提取法[8-9]、微波輔助提取法[10]、超聲波提取法[11]。高壓脈沖電場是一種具有非熱特性的新型技術，它穿透力強，對食品處理均勻、徹底[12-13]，因在常溫常壓條件下，可通過瞬時破壁使細胞膜通透性發生變化，從而使物質溶出，故可利用其提取植物有效成分[14]，但未見高壓脈沖電場提取葛花黃酮的報道。本文采用高壓脈沖電

場法提取葛花黃酮，并對葛花黃酮的提取工藝進行了優化，從而保留黃酮的生物活性，以期為合理利用葛花資源及功能性保健食品的研發，提供科學的數據，奠定堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛花：市售無霉變干制品；鳶尾苷標準品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇：北京化工廠。

1.2 主要儀器與設備

高壓脈沖電場設備：吉林大學研制；JY92-II超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外可見分光光度計（UV2100型）：UNICO公司；大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；FW100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有點公司；YD4002型電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-4A數顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓脈沖電場法提取葛花黃酮得率的測定

1.3.1.1 標準曲線的繪制

準確稱取5mg鳶尾苷標準品，用70%乙醇配制成濃度為200μg/mL鳶尾苷標準溶液，準確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL棕色容量瓶中，用70%乙醇溶液定容刻度，以70%乙醇溶液為空白對照樣，在266 nm處測定吸光度。

1.3.1.2 葛花黃酮得率的計算

將經過提取的葛花溶液加入60%乙醇溶液定容于100mL，離心分離后，取適量溶液進行稀釋后，按照標準曲線的制作方法測定樣品的吸光度值，并根據公式（1）計算葛花黃酮得率。

式中：Y為葛花黃酮得率，%；C為根據樣品吸光度值在標準曲線上計算得到的葛花黃酮含量，μg/mL；V為葛花提取液體積，mL；N為稀釋倍數；M為葛花質量，g。

1.3.2 高壓脈沖電場提取葛花黃酮試驗設計

1.3.2.1 單因素試驗設計

1）乙醇濃度對葛花黃酮得率的影響：在料液比為1∶30（g/mL），電場強度為15 kV/cm，脈沖數為8個的條件下，考察乙醇濃度為50%、55%、60%、65%、70%時對葛花黃酮得率的影響。

2）料液比對葛花黃酮得率的影響：在乙醇濃度為60%的條件下，設定電場強度為15 kV/cm，脈沖數為8個進行試驗，考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）時對葛花黃酮得率的影響。

3）電場強度對葛花黃酮得率的影響：當乙醇濃度為60%，料液比為1∶30（g/mL）時，將脈沖個數設定為8個進行試驗，考察電場強度為5、10、15、20、25 kv/cm時對葛花黃酮得率的影響。

4）脈沖數對葛花黃酮得率的影響：在乙醇濃度為60%，料液比為1∶30（g/mL），電場強度為15 kV/cm的條件下，考察脈沖數為4、6、8、10、12個時對葛花黃酮得率的影響。

1.3.2.2 響應面優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用四因素三水平Box-Behnken試驗設計方法，選取最優水平進行響應面分析，以葛花黃酮得率為考核指標，確定最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以鳶尾苷標準溶液的濃度為橫坐標，以吸光值A為縱坐標，制得標準曲線如圖1所示，回歸方程為Y= 0.063 2X-0.020 9，R2=0.998 3。

鳶尾苷標準曲線見圖1。

圖1 鳶尾苷標準曲線Fig.1 Standard curve for tectoridin

2.2 單因素試驗結果及分析

2.2.1 乙醇濃度對葛花黃酮得率的影響

乙醇濃度對葛花黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Effectsof theethanolconcentration rateon total flavonoids yield

由圖2可知，當乙醇濃度為60%時，葛花黃酮的得率最高。適當的乙醇濃度可以加速葛花黃酮的溶出，但當乙醇濃度高于60%時，黃酮得率反而有所降低，再綜合考慮試劑浪費等問題，因此，選擇乙醇濃度55%～65%為最適范圍。

2.2.2 液料比對葛花黃酮得率的影響

液料比對葛花黃酮得率的影響見圖3。

圖3 液料比對黃酮得率的影響Fig.3 Effectsof the stuff-liquid ratio rateon total flavonoidsyield

由圖3可知，葛花黃酮得率隨著料液比的升高而增大，當液料比為1∶30（g/mL）時，葛花黃酮得率最高，隨后得率基本穩定。適當料液比可以加速葛花黃酮的溶出，這可能是因為隨著料液比的增加，使得葛花粉與溶劑接觸面的濃度差增大，因此提高了傳質速率[15]。但當料液比高于1∶30（g/mL）時黃酮得率增減幅度減小，隨后不再增加，再綜合考慮能源消耗等問題，因此選擇料液比為1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）為最適水平范圍。

2.2.3 電場強度對葛花黃酮得率的影響

電場強度對葛花黃酮得率的影響見圖4。

圖4 電場強度對黃酮得率的影響Fig.4 Effectsof theelectric field intensity rateon total flavonoids yield

適當的外加電場作用，可以降低細胞膜的保護作用，使其結構紊亂，從而致使細胞膜破裂，提高通透性[16]。由圖4可知，隨著電場強度的增加，葛花黃酮的得率升高，當電場強度為15 kV/cm時，黃酮得率達到最大值。這是由于極性溶劑隨著電場強度增加，運動速度加快，使更多的溶劑進入到細胞內，從而細胞內的物質能夠更容易地滲透出來；另一方面可能是因為物料間內外的電場強度差異作用使得細胞膜被破壞[17]，細胞穿孔，葛花中的黃酮物質更易溶出。但隨著電場強度的增大，葛花黃酮的得率反而有所下降，這可能是由于過大的電場強度使得黃酮結構發生了破壞，并且場強過大對機器有一定的損害，可能會有打火現象的發生。

2.2.4 脈沖數對葛花黃酮得率的影響

脈沖數對葛花黃酮得率的影響見圖5。

圖5 脈沖數對黃酮得率的影響Fig.5 Effectsof theelectric pulsenumber rateon total flavonoidsyield

圖5 可知，當脈沖數為8個時，葛花黃酮得率最大。脈沖數過小，對細胞的破壞程度不明顯，不利于黃酮的溶出，得率低。增大脈沖數，電場的作用頻率增強，使得細胞的破壞程度與數量增大，得率升高。但脈沖數過大，由于電場對物料作用頻率過大，時間過長，產生了不穩定因素，使得黃酮結構發生變化，從而影響葛花黃酮得率。

2.4 高壓脈沖電場提取葛花黃酮工藝優化

2.4.1 數學模型的建立與方差分析

通過單因素試驗，應用Box-Behnken中心組合進行四因素三水平的試驗設計，試驗因素及水平安排見表1根據中心組合試驗與Box-Behnken試驗設計原理[18]，得響應面試驗結果見表2，方差分析結果見表3，可信度分析結果見表4。

表1 響應面分析因素和水平表Table1 The tableof factorsand levelsused in response surface analysis

根據Design-Expert軟件，對結果進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到以黃酮得率為目標函數，進行方差分析及顯著性檢驗，得到各條件編碼

值的二元回歸方程為：

表2 響應面試驗結果Table2 Resultsof corresponding experimental

表3 回歸模型的方差分析Table3 Varianceanalysis for the developed regressionmodel

續表3 回歸模型的方差分析Continue table3 Varianceanalysis for the developed regression m odel

表4 回歸模型的可信度分析Table4 Reliability analysisof theestablished regressionmodel

對響應面結果進行回歸分析，各因素對試驗的影響是否顯著可以通過P[19]值確定。由上述表中結果可知，回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型（P＜0.000 1）具有高度顯著性，說明該模型成立，該模型的失擬項（P=0.071＞0.05）并不顯著，說明模型與真實情況之間無顯著性差異，這兩者同時表明該模型的擬合性較好。上述回歸方程的相關系數為R2=0.985 7，說明模型與實際擬合較好，該試驗方法可靠[20]。該模型的變異系數C.V.%=0.76，說明該模型的重復性良好。在回歸模型中，一次項A、B、C、D，交互項AC、AD、BC、BD、CD，二次項A2、B2、C2、D2均表現出了顯著水平。通過F值的比較，得出該模型各因素對響應值影響的顯著性大小為：料液比＞電場強度＞乙醇濃度＞脈沖數，兩兩交互作用對黃酮提取影響大小為AD>BC>AC>BD>CD>AB。2.4.2 各因素的交互作用對葛花黃酮提取的響應面分析

各因素之間兩兩交互作用見圖6。

圖6 三因素的交互作用Fig.6 Respanse surfacechartof three factors

由圖6中可以看出各圖均成開口向下、凸形的曲面，并且都具有極值。由a可以看出，乙醇濃度（A）和料液比（B）等高線成圓形，說明兩者之間交互作用不顯著，在試驗范圍內隨著乙醇濃度（A）和料液比（B）的不斷增大，黃酮得率均呈現先增大后減小的趨勢。從圖中可以看出當乙醇濃度（A）在59%～61%、料液比（B）為1∶31（g/mL）～1∶33（g/mL）時黃酮的得率達到峰值。b、d、e、f等高線均成橢圓形，說明兩兩交互作用極為顯著，并且黃酮得率隨著各因素值的不斷增大，均先增大后減小。由c可以看出，乙醇濃度（A）和脈沖數（D）交互作用較顯著，隨著兩者不斷增大，黃酮的得率呈現先增大后小。當乙醇濃度（A）處于較低水平時，黃酮得率隨著脈沖數（D）的增長不斷提高。當乙醇濃度超過60%以后，黃酮得率雖然隨著脈沖數（D）的增大而增加，但增加的幅度較小，當乙醇濃度（A）處于高水平時黃酮的得率有所下降。當脈沖數（D）較小時，得率隨著乙醇濃度（A）的增大而增加，當脈沖數（D）高于9以后，得率隨著脈沖數（D）的增加變化幅度逐漸變小。

2.4.3 響應面優化最佳工藝參數

通過響應面法對試驗數據進行優化后，通過分析可以得出葛花黃酮提取的最佳工藝參數為：乙醇濃度60.59%料液比1∶32.18（g/mL），電場強度16.66 kV/cm，脈沖數8.58個，此時黃酮得率為10.455%。

2.4.4 驗證試驗

為了驗證試驗結果與實際情況是否一致，根據模型所給出的試驗方案進行驗證性試驗，考慮試驗的方便情況，對結果進行取整后得到的最佳工藝參數為：乙醇濃度60%、料液比1∶32（g/mL），電場強度16 kV/cm，脈沖數8個。在此條件下，實際測得的葛花黃酮得率為10.373%，理論值為10.455%，相差0.082%，因此，利用響應面法對葛花黃酮提取條件進行優化是可行的，得到的葛花黃酮提取條件具有實際的應用價值，為實際操作提供技術參考。

3 結論

高壓脈沖電場提取葛花黃酮具有能耗小、時間短、對熱敏性物質的破壞程度較小等優點。以葛花為原料，利用高壓脈沖電場技術提取葛花黃酮，通過響應面試驗，確定最佳提取條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶32（g/mL），電場強度16 kV/cm，脈沖數8個，得率為10.373%。

[1]尹俊亭,仲英,孫敬勇,等.葛花化學成分的研究 (Ⅰ)[J].中草藥, 2006,37(3):350-352

[2]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部).北京:化學工業出版社,2000,273-274

[3]Min SW,Kin DH.Kakkalide and irisolidone.HMC-CoA reductase inhibitors isolated from the Flower of Pueraia thunbergiana[J].BiologicalPharmaceuticalBulletin,2007,30(10):1965-1968

[4]Choi J,Shin M H,Park K Y,et al.Effect of kaikasaponin IIIob－tained from Pueraria thunbergiana flowers on serum and hepatic lipid peroxides and tissue factor activity in the streptozotocin-induced diabetic rat[J].JournalofMedicinal Food,2004,7(1):31-37

[5]Yamazaki T,YaguchiM,Nakajima Y,et al.Effects of an aqueous extractof Puerariae floson impairmentof passive avoidance behavior inmice[J].JournalofEthnopharmacology,2005,100(3):244-248

[6]Park H J,Han SM,YoonW J,etal.The effectsof Puerariae Floson stress-induced deficits of learning and memory in ovariectomized female rats[J].The Korean Journal of Physiology＆Pharmacology, 2009,13(2):85-89

[7]張淑萍,張尊聽.野葛花異黃酮化學成分研究[J].天然產物研究與開發,2005,17(5):595-597

[8]楊向東,劉博,陳四艷,等.正交試驗法優選葛花總異黃酮提取工藝的研究[J].湖北中醫雜志,2008,30(8):60-61

[9]孫學惠,史國兵,趙慶春,等.葛花提取工藝研究[J].中國藥師, 2011,14(7):973-975

[10]汪新亮,吳基良,楊靜.葛花總異黃酮的提取與純化[J].中成藥, 2009,31(7):1120-1122

[11]胡虹,許雅娟,劉世君,等.微波助溶提取云臺山野葛花總黃酮的研究[J].化工時刊,2006,20(11):37-39

[12劉鳳霞,孫建霞,李靜,等.高壓脈沖電場技術在食品加工中的應用研究新進展[J].食品與發酵工業,2010,36(4):138-142

[13]胡珂文,王劍平,蓋鈴,等.高壓脈沖電場在食品加工中的應用前景[J].食品工業科技,2007(6):226-229

[14]盧沿鋼,董全.高壓脈沖電場提取食品中天然產物的研究進展[J].食品與機械,2012,28(1):243-245

[15]陶亮亮,胡瑞,丁雷濤,等.超聲輔助提取薄荷中總黃酮的工藝研究[J].飲料工業,2011,14(6):31-33

[16]盧敏,畢艷春.高壓脈沖電場提取麩皮多糖影響因素的研究[J].糧食加工,2009,34(1):31-33

[17]張曉輝,張志霞,李艷貞,等.基于細胞多層介電模型的脈沖電場生物學效應研究[J].農業機械學報,2014,45(4):253-258

[18]FERREIRA S L C,BRUNS R E,FERREIRA H S,et al.Box-Behnken design:An alternative for the optimization of analytical methods[J].AnalyticalChimica Acta,2007,597(2):179-186

[19]SHENGLIY,HUIZ.Optimization of cholesterol oxidase production by Brevibacterium sp.employing response surfacemethodology[J]. African JournalofBiotechnology,2012,11(13):8316-8322

[20]徐向宏,何明珠.試驗設計與Design-Expert、SPSS應用[M].北京:科學出版社,2010:149-155

Technology Optim ization of Total Flavonoids Extraction from Pueraria lobata by the High-intensity Pulsed Electric Fields Assistance

DAIMing-jun1，YOU Li-xin2，WEN Lian-kui1，*，YINYong-guang3
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.College ofOrganism and Food，Changchun University ofScience and Technology，Changchun 130600，Jilin，China；3.Collegeof Biologicaland AgriculturalEngineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

Pueraria lobata wasused as rawmaterial toextract total flavonoidsby thehigh-intensity pulsed electric fields，with theyield of total flavonoidsas index，based on thissingle factorexperiment，the effectsofstuffliquid ratio，electric field intensity，and electric pulse number on the yield of total flavonoidswere discussed by respons surfacemethodology，and determined the bestextraction process parameters of these three factors.The results showed that，themost yield rate 10.373%by total flavonoidswas achieved under the following conditions theethanolconcentrations60%，ratioofstuff-liquid ratio1∶32（g/mL），electric field intensity16 kV/cm，electric pulsenumber8.

high-intensity pulsed electric fields；extraction；Pueraria lobata；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.023

2016-02-23

吉林省教育廳“十二五”科學技術項目：葛花解酒飲品的開發研究（[2012]第517號）

代名君（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工。

*通信作者：文連奎（1962—），男，教授，研究方向：長白山野生資源的開發利用。