HPLC-ICP-MS聯用技術測定水產品中的汞形態

陳巖，劉永濤，趙曉麗，楊慧，耿安靜，王富華，3，*

（1.廣東省農業科學院農產品公共監測中心，廣東廣州510640；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510640；3.農業部農產品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東廣州510640；4.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北武漢430223）

HPLC-ICP-MS聯用技術測定水產品中的汞形態

陳巖1，2，劉永濤3，4，趙曉麗1，楊慧1，2，耿安靜1，王富華1，2，3，*

（1.廣東省農業科學院農產品公共監測中心，廣東廣州510640；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510640；3.農業部農產品質量安全檢測與評價重點實驗室，廣東廣州510640；4.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北武漢430223）

建立了鹽酸超聲輔助提取-HPLC-ICP-MS測定水產品中汞形態的分析方法。通過對水產樣品進行預先脫脂，以5mol/L鹽酸為提取劑，超聲水浴提取60min。以95%A相（10mmol/L乙酸銨+0.12%L-半胱氨酸）和5%B相（無水乙醇）作為流動相，經C18反相高效液相色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）等度洗脫，202Hg為ICP-MS的檢測離子，5min實現3種形態汞的完全分離。本方法的線性范圍為0～100μg/L（r≥0.999 3），檢出限為0.11μg/L～0.19μg/L，加標回收率為79.84%～92.76%，RSD為2.86%～6.72%（n=6）。該方法具有分離時間短、綠色環保、靈敏度高、回收率滿意等特點。

高效液相色譜；電感耦合等離子體質譜；汞；超聲輔助提取；形態分析

汞是影響人類健康和生態環境最具危害性的元素之一，它以各種各樣的物理或化學形式存在。近年來，隨著水環境污染的日益嚴重，水產動植物通過直接吸收富集、食物鏈的生物放大等作用在體內富集相當數量的汞，水產品的攝取已成為人類暴露于汞的主要途徑[1]。汞的常見形態有元素汞（Hg0）、無機汞（Hg2+及其化合物）和有機汞（甲基汞MeHg和乙基汞EtHg），不同形態汞的特性決定了其復合物分布、生物學富集和毒性，其中甲基汞的毒性最大[2]。因此，如何快速準確測定汞形態對水產品中汞的安全風險評估至關重要。

目前，基于色譜分離技術與原子光譜或質譜等檢測技術聯用技術被認為是樣品中汞形態分析較理想的方法，包括高效液相色譜-原子熒光光譜法（HPLCAFS）[3-5]、氣相色譜-原子熒光光譜法（GC-AFS）[6]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP-MS）[7]、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜法（GC-ICP-MS）[8]等。盡管HPLC-AFS法被認定為我國食品安全標準中甲基汞測定的規定方法[9]，其靈敏度與液相色譜-電感耦合等離子體質譜法相比仍有待較大的改善。隨著ICP-MS儀器國產化的推進，HPLC-ICP-MS必將成為食品中汞形態分析的常用方法。本研究在以往HPLCICP-MS研究的基礎上，通過對樣品前處理及色譜分離條件進行合理優化，獲得一種更加綠色環保的汞形態測定方法，該方法適用于水產品中不同形態汞的分析檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀-Agilent7700x型電感耦合等離子體質譜儀、ZORBAX SB C18色譜柱（4.6×150mm，5μm）、Eclipse plusC18色譜柱（4.6mm× 150mm，5μm）：美國Agilent公司；ETHOSOne微波消解系統：意大利Milestone公司；AL204型電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q型純水系統：美國Millipore公司。

乙醇（色譜純）、L-半胱氨酸（純度99%）、乙酸銨（純度99.99%）、氨水（色譜純）、鹽酸（優級純）、氫氧化鉀（優級純）：阿拉丁試劑公司；甲基汞標準溶液（GBW 08675，濃度76.6μg/g±2.9μg/g）、乙基汞溶液標準物質（GBW（E）08152，濃度75.3μg/g±2.8μg/g）、紫菜成分分析標準物質（GBW10023）、生物成分分析標準物質（大蝦，GBW10050）：中國計量科學研究院；無機汞（Part#8500-6940，濃度10mg/L）：美國Agilent公司；魚、紫菜、海帶等水產品樣品：購自廣州市區大型超市。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

本課程教學大綱以一個與授課專業相關的專題項目——專題數據庫管理系統的具體實現為項目案例，對課程學時分配、教學目標、教學任務、各單元教學內容及基本要求、課程考核等進行設計。以項目數據庫系統的設計、應用開發為案例，貫穿教學全過程，即通過這個實際數據庫應用開發項目的層層推進，使學生在學習解決問題的過程中，學會數據庫的應用技術、原理和工具的使用，培養學生成為能夠勝任生產、服務、技術和管理工作的高素質勞動者和高級技術應用型人才。

將市場上購買的魚類樣品去除頭、骨及內臟部分，切成小塊狀后用勻漿機攪碎，放置于-18℃冰箱內保存。紫菜和海帶樣品用剪刀剪碎后用粉碎機制成粉末。

1.2.2 總汞的測定

參照GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》的方法，即稱取1.0 g混勻樣品于50mL消解罐中，加入8mL硝酸，于微波消解儀上消解。消解完畢后轉移至25mL容量瓶，定容至刻度，搖勻后在原子熒光光譜儀上測定[9]。樣品測定過程中以紫菜（GBW10023）和大蝦（GBW 10050）兩種標準物質作為質控樣。

1.2.3 汞形態的測定

稱取約5.0 g樣品于50mL離心管中，加入10mL丙酮，渦旋1min，3 500 r/min離心5min，傾掉丙酮溶液。準確加入10mL 5mol/LHCl溶液，渦旋混勻，室溫下在超聲水浴中萃取60min，再用濃氨水調節pH值至中性，以3 500 r/min的速度離心20min，收集上清液，過0.45μm濾膜后進行HPLC-ICP-MS測定。

1.2.3.1 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18色譜柱，流動相為5%乙醇-10mmol/L乙酸銨-0.1%半胱氨酸，pH 7.50，流速為1.0mL/min，進樣體積為10μL。

1.2.3.2 電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）條件

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優化

樣品前處理過程中保證待測組分形態的穩定和提取完全是檢測結果準確的重要因素之一。魚類水產品由于富含蛋白質、脂肪等有機物，基質比較復雜。本試驗通過在提取前加入少量丙酮去除樣品中的脂肪，有效避免直接提取過程產生的乳化現象。酸、堿提取是常見的汞提取方法，在強酸強堿作用下，結合在魚肉樣品蛋白質巰基上的脂溶性有機汞可得到有效釋放[10-12]。由于強堿提取過程中更容易發生甲基汞和汞之間的形態轉化[10]。因此，本試驗確定在樣品經丙酮脫

脂后，借鑒Reye等人的研究結果[13]，選擇以5mol/L的鹽酸作為提取劑。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 絡合劑的選擇

在反相HPLC分離汞化合物時，需要加入少量的絡合劑與待測物形成不同極性的復合物，有機硫化合物如L-半胱氨酸、2-巰基乙醇則是常用的絡合劑[14]。不同絡合劑對3種形態汞的色譜圖影響見圖1。

圖1 不同絡合劑對3種形態汞的色譜圖影響Fig.1 Chromatogram sof Hg2+，methylmercury and ethylmercury w ith different complex agents in themobile phase

由圖1可知，本研究采用5%體積比甲醇、10 mmol/L乙酸銨、0.12%質量體積比L-半胱氨酸為流動相時，大約5min就能實現3種汞化合物的完全分離；而當以巰基乙醇代替L-半胱氨酸時，Hg2+和甲基汞存在嚴重的峰重疊無法完全分離，乙基汞的出峰時間延長至30min。若以乙醇、乙腈代替甲醇，Hg2+和甲基汞的峰更是完全重合。除此之外，L-半胱氨酸作為流動相時的峰信號要明顯強于巰基乙醇，且巰基乙醇具有強烈的惡臭味，綜合考慮選擇0.12%L-半胱氨酸作為絡合劑。

2.2.2 有機相的選擇

甲醇、乙腈是色譜分離中常用的有機相，乙醇則因為黏度大很少作為流動相。本研究分別比較了含有5%的甲醇、乙醇、乙腈3種有機相對3種汞化合物分離時間、采集信號強度及柱壓的影響。流動相中有機相組成對3種形態汞的色譜圖影響見圖2。

圖2 流動相中有機相組成對3種形態汞的色譜圖影響Fig.2 Chromatogramsof Hg2+，methylm ercury and ethylmercury at thepresenceof differentorganic components in them obile phase

由圖2發現，以上3種有機相作為流動相組分均可以實現3種汞化合物的完全分離，但分離時間為甲醇＞乙醇≈乙腈，對柱壓的影響為乙醇＞甲醇＞乙腈，等離子體質譜信號強度三者沒有顯著區別。由于流動相僅含有5%的有機相，由5%乙醇引起的色譜系統柱壓增加影響有限（62MPa增加至66MPa），但相比甲醇和乙腈，具有分離時間短、試劑消耗少、綠色環保等優點，因此選擇5%的乙醇作為流動相中有機相。

2.2.3 色譜柱的選擇

分別采用ZORBAXSBC18和EclipseplusC18色譜柱對3種汞化合物進行比較分析，相應的譜圖見圖3。

由圖3發現，通過所確定的中性pH流動相，兩根色譜柱都能實現3種汞化合物的完全分離，且分離時間、出峰位置均無明顯區別（圖3），但ZORBAX SBC18色譜柱的耐水性更強，而流動相中有機相過高，容易引起ICP-MS錐口堵塞和等離子體火焰不穩定而熄火，因此ZORBAX SBC18色譜柱更適用于本研究中僅含5%有機相的流動相體系。

圖3 不同色譜柱對3種形態汞的色譜圖影響Fig.3 Chromatogramsof Hg2+，methylmercury and ethylm ercury under different chromatographic columns

2.3 汞的形態分析

2.3.1 標準曲線與檢出限

配制0、1、5、10、20、40、100μg/L的無機汞（Hg2+）、甲基汞和乙基汞的混合標準溶液于最佳儀器條件下進行測試，以標準溶液濃度對積分面積進行線性擬合，繪制標準曲線。以3倍信噪比（S/N）確定無機汞（Hg2+）、甲基汞和乙基汞的檢出限。線性方程、相關系數及檢出限見表1。

表1 無機汞（Hg2+）、甲基汞和乙基汞的線性方程、相關系數及檢出限Table1 Regression equations，correlation coefficientsand detection lim itsof Hg2+，m ethylm ercury and ethylmercury

2.3.2 精密度和回收率

精密稱取同一魚肉樣品和紫菜樣品各12份，分別進行高、中、低兩個濃度的加標回收試驗，按照1.2.3的方法測定，結果見表2。

由表2可知，高、中、低加標濃度水平下，不同樣品基質（動物性基質魚肉和植物性基質紫菜）中3種形態汞加標回收率分別為79.84%～88.60%和82.40%～92.76%，相對標準偏差（n=6）為2.99%～6.72%和2.86%～5.61%，表明該方法具有較高的回收率和精密度，適合動、植物性水產品汞形態的分析檢測。

表2 不同樣品基質下3種形態汞的加標回收率Table2 Recoveriesof Hg2+，m ethylmercury and ethylmercury with differentsam plematrixesspiked at two levels（n=6）

2.4 樣品的分析

將采集的12種水產樣品經上述前處理后，用原子熒光光譜法測定水產品中的總汞含量，同時采用本研究的HPLC-ICP-MS方法分析水產品中的汞形態，并比較總汞含量與各形態汞含量的加和值，結果見表3。

表3 水產樣品中3種形態汞化合物及總汞含量測定結果Table3 Contentsof Hg2+，methylmercury，ethylm ercury and total m ercuy in aquatic samples

由結果可知，兩種結果比值在85.2%～120.4%之間，測定魚肉及紫菜海帶等樣品中總汞含量較低，其中汞的形態以甲基汞為主，同時存在少量無機汞。根據我國食品安全國家標準的規定，水產動物中甲基汞衛生限量為0.5mg/kg，肉食性魚類及制品為1.0mg/kg[15]。本研究所測水產品中甲基汞的含量均未超標。

3 結論

高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜已逐漸成為重金屬形態分析的重要技術手段。本研究在以往研究的基礎上，通過對樣品前處理過程進行適當優化，并以無毒的乙醇代替常用的甲醇、乙腈等作為有機相，以L-半胱氨酸作為絡合劑，5min內實現Hg2+、甲基汞、乙基汞3種汞形態的分析，具有分離時間短、綠色環保、靈敏度高、回收率滿意等優點，適用于水產品中汞的形態分析。

[1]高志杰,汪娌娜,鄭海波,等.寧波市2012年市售海產品中重金屬鉛、汞、鎘、鉻污染狀況分析[J].中國食品衛生雜志,2014,26 (1):76-78

[2]Wiener JG.Mercury exposed:advances in environmetal analysis and ecotoxicology ofahighly toxicmetal[J].Environmental Toxicologyand Chemistry,2013,32(10):2175-2178

[3]Chen YW,Belzile N.High performance liquid chromatography coupled to atomic fluorescence spectrometry for the speciation of the hydride and chemical vapour-forming elements As,Se,Sb and Hg: A critical review[J].AnalyticaChimica Acta,2010,671(1/2):9-26

[4]肖亞兵,崔穎,陳文碩,等.液相色譜-原子熒光法測定魚肉中有機汞形態[J].食品研究與開發,2014,35(21):106-108

[5]曾艷,徐開來,侯賢燈.色譜與原子熒光光譜聯用技術在元素形態分析中的應用[J].分析科學學報,2014,30(3):428-432

[6]Sánchez-Rodas D,CornsW T,Chen B,et al.Atomic Fluorescence Spectrometry:a suitable detection technique in speciation studies for arsenic,selenium,antimony andmercury[J].Journal of Analytical Atomic Spectrometry,2010,25(7):933-946

[7]Yin YG,Liu JF,JiangGB.Recentadvancesin speciation analysisof mercury,arsenic and selenium[J].Chinese Science Bulletin,2013, 58(2):150-161

[8] 潘怡,林長青,高鵬.在線衍生化吹掃捕集-氣相色譜質譜聯用法檢測地表水中的甲基汞和乙基汞[J].環境化學,2014,33(1): 171-172

[9]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.17-2014食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定[S].北京:中國標準出版社,2014

[10]Reyes L H,Rahman G M M,Fahrenholz T,et al.Comparison of methodswith respect to efficiencies,recoveries,and quantitation of mercury species interconversions in food demonstrated using tuna fish[J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2008,390(8):2123-2132

[11]Shaq AQ,KaziTG,Baig JA,etal.Simultaneously determination of methyl and inorganicmercury in fish speciesby cold vapor generation atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry,2012,134 (4):2345-2349

[12]高爾樂,何濱,江桂斌,等.利用堿消解-HPLC-ICP-MS系統測定生物樣品中的甲基汞與乙基汞 [J].環境化學,2009,28(2): 310-312

[13]Reyes L H,Rahman GM M,Kingston H M S.Robustmicrowaveassisted extraction protocol for determination of totalmercury and methylmercury in fish tissues[J].Analytica Chimica Acta 2009,631 (2):121-128

[14]KodamataniH,Matsuyama A,Saito K,etal.Sensitive determination method formercury ion,methyl-,ethyl-,and phenyl-mercury in water and biological samples using high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection[J].Analytical Science,2012,28(10):959-965

[15]中華人民共和國衛生部.GB 2762-2012食品安全國家標準食品污染物限量[S].北京:中國標準出版社,2012

Determ ination of M ercury Species in Aquatic Products by HPLC-ICP-MS

CHENYan1，2，LIU Yong-tao3，4，ZHAOXiao-li1，YANGHui1，2，GENGAn-jing1，WANG Fu-hua1，2，3，*
（1.Public Monitoring Center for Agro-product，Guangdong Academy of Agricultural Science，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.Laboratory ofQuality&Safety Risk Assessment for Agro-product（Guangzhou），Ministry of Agriculture，Guangzhou 510640，Guangdong，China；3.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-productSafety and Quality，Ministry ofAgriculture，Guangzhou 510640，Guangdong，China；4.Yangtze River FisheriesResearch Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，Hubei，China）

HPLC-ICP-MS technique for determination of threemecury species in aquatic productswas developed.Fat in the aquatic sampleswas firstly removed by acetone，different speciation ofmercury was then extracted by 5mol/L hydrochloric acid solution for 60min with the assistof ultrasound bath.The separation was carried outon a C18 column（4.6mm×150mm，5μm）with 95%A phase containing 10mmol/L ammonium acetate and 0.12%L-cysteine and 5%ethanol.202Hgwas selected as detection ion of ICP-MS.Threemercury species was completely separated in fiveminutes.The calibration curves were linear within the range of 0-100μg/L（r≥0.999 3），and the detection limits were 0.11μg/L-0.19μg/L.The recoveries for Hg2+，methylmercuryand ethylmercurywere79.84%-92.76%，and relative standard deviations（RSD）were2.86%-6.72%（n=6）.Themethod has the characteristicsofshortseparation time，green，high sensitivity，and satisfactory recovery rate.

high performance liquid chromatography；inductively coupled plasma mass spectrometry；mercury；ultrasonic-assisted extraction；speciation analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.030

2016-02-22

國家自然科學基金項目（41401367）；廣東省農業攻關項目（2012A020100002）；廣東省促進科技服務業發展計劃項目（2012B040302012）

陳巖（1982—），男（漢），助理研究員，博士研究生，研究方向：食品安全檢測及標準法規研究。

*通信作者：王富華（1962—），男（漢），研究員，研究方向：農產品質量安全。