HPLC檢測苦蕎制品中黃曲霉毒素B1的可行性探討

林巧，鞏發永，肖詩明

（西昌學院苦蕎麥重點實驗室，四川西昌 615000）

HPLC檢測苦蕎制品中黃曲霉毒素B1的可行性探討

林巧，鞏發永，肖詩明

（西昌學院苦蕎麥重點實驗室，四川西昌 615000）

本試驗對HPLC測定苦蕎制品中AFB1的可行性進行研究，研究HPLC法測定黃曲霉毒素B1的標準曲線、準確度、精密度、系統誤差、靈敏度，結果表明HPLC分析方法的檢測范圍0.20μg/L～200.00μg/L，判定系數R2=0.996 8，各個數據的相對誤差分別是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%，苦蕎芯粉平均加標回收率為84.58%，檢測出苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素Bl的變異系數分別是9.36%、5.25%、8.22%。檢測靈敏度最低檢測限0.20μg/L。

HPLC；黃曲霉毒素B1；苦蕎制品；方法學

本試驗試圖對HPLC法定量檢測黃曲霉毒素B1的可行性進行的系統研究。通過研究HPLC法測定黃曲霉毒素B1的標準曲線、精密度、靈敏度、準確度和不同苦蕎制品對檢測結果的影響，建立了HPLC方法評價指標，確立了HPLC定量分析的質控參數，證實HPLC方法用于苦蕎制品中黃曲霉毒素B1檢測具有可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和材料

三氟乙酸、正己烷、乙腈、黃曲霉素B1標準品：中國標準計量局；苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎粉、苦蕎茶：西昌航飛苦蕎科技發展有限公司。

1.2 儀器和設備

高效液相色譜系統（反相C18柱，熒光檢測器）：安捷倫科技有限公司；HZK-FA210電子天平：美國華志；臺式高速冷凍離心機：上海趙迪。

1.3 方法

1.3.1 繪制HPLC檢測毒素B1的標準曲線

為了考察HPLC范圍，需繪制HPLC黃曲霉毒素B1的標準曲線。將黃曲霉毒素B1標準液濃度按0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次加到高效液相色譜中，并嚴格按照HPLC的檢測步驟依次操作，測得峰面積，以標液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標來繪制檢測曲線。

1.3.2 HPLC檢測曲霉毒素B1的準確度

用相對誤差來衡量該方法的準確度[7]。為了研究

用HPLC測定黃曲霉毒素B1的準確度，精確吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黃曲霉毒素B1標品溶液20μL重復進樣3次可以計算出相對誤差，相對誤差應小于10%。

1.3.3 HPLC測定黃曲霉毒素B1的系統誤差

用樣品加標回收率試驗來衡量該方法的系統誤差[8]。為研究HPLC測定黃曲霉毒素Bl的系統誤差，將濃度為12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黃曲霉毒素標液，分別添加50μL到5.00 g的苦蕎粉樣品中，制備不同污染程度的樣品[9]，按照測定苦蕎樣品中黃曲霉素B1的含量。回收率不低于70%[10]。

式中：P為加標回收率，%；C1為試樣濃度，μg/L；C2為加標試樣濃度，μg/L；C3為加標量，μg/L。

1.3.4 HPLC檢測曲霉毒素B1的精密度

用變異系數來衡量該方法的精密度[11]。為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的精密度，分別取5.0g苦蕎粉、苦蕎茶、苦蕎面樣品5份，處理后測定黃曲霉毒素B1的含量，并按照下列公式計算其變異系數，變異系數CV越小，精密度越好。當HPLC法的變異系數的值小于10%時[10]，可認為該試驗的精密度好。

式中：SD為標準偏差；Xi為樣品中霉毒素B1的含量，μg/kg；X為黃曲霉毒素B1的平均含量，μg/kg；n為樣品組數；CV為變異系數，%。

1.3.5 HPLC檢測曲霉毒素B1的靈敏度

用信噪比來衡量該方法的靈敏度[12]。為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的靈敏度，先進空白溶劑，測出噪音峰高N。再進樣0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黃曲霉毒素B1標品，當檢測濃度的色譜峰高是噪音色譜峰高的3倍，即信噪比S/N=3時，該濃度即為最小檢測濃度。

1.4 HPLC檢測曲霉毒素B1含量的方法

1.4.1 樣品的處理及制備

取5 g粉碎苦蕎樣品至50mL的離心管中，加入20mL乙腈-水（84+16，體積比）提取液，在電動振蕩器上震蕩30min，1000 r/min真空離心15min，取上清液。

1.4.2 試樣凈化

移取約8mL上清液至多功能凈化柱，插入玻璃管中并緩慢推動填料管，收集凈化液。

1.4.3 試樣衍生化

將2μL凈化液轉移塞小瓶中，注意避光。在烘干機中（85±1）℃吹干。加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷，密閉混勻30 s后，在（40±1）℃烘干箱中衍生15min再用溫吹干。以水-乙腈（85+15，體積比）200μL溶解，混勻30 s，1 000 r/min真空離心15min，取上清液樣品瓶中備用。

1.4.4 標準溶液的制備

準確移取2.00μg/mL黃曲霉毒素B1標準品1mL至10mL容量瓶中，配置濃度為200.00μg/L的標準溶液；取5mL濃度為200.00μg/L的標準溶液至10mL容量瓶中配制成100.00μ/L的標準溶液；取5mL濃度為100.00μg/L的標準溶液至10mL容量瓶中配制成50.00μg/L的標準溶液；取5mL濃度為50.00μg/L的標準溶液至10mL容量瓶中配制成25.00μg/L的標準溶液；吸取標準溶液200μL，在烘干機中85℃吹干，衍生化方法同1.4.3。

1.4.5 測定及條件

色譜柱：4.6mm×150mm，5μm，C18；柱溫：30℃；流動相：乙腈（色譜純）17%，水83%；流速：0.50mL/min；進樣量：20μL；熒光檢測器：激發波長：360 nm：發射波長440 nm[13]。

1.4.6 測定

以標準品的峰面積對濃度繪制標準曲線，通過保留時間的比較確定黃曲霉毒素B1的峰，根據峰面積計算試樣中黃曲霉毒素B1含量。計算樣品中黃曲霉毒素B1的濃度：

式中：C為試樣中黃曲霉毒素B1的濃度，μg/L；A為試樣按照外標法在標準曲線中對應的濃度，μg/L；V為試樣提取液體積，mL；m為試樣的取樣量，g；f為試樣溶液衍生后較衍生前的濃縮倍數。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測曲霉毒素B1的標準曲線

將黃曲霉毒素 B1標準液濃度按 0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次衍生后在激發波長為360 nm，發射波長為440 nm柱溫為30℃的條件下分別進樣20μL，測定出AFB1的峰面積，見圖1，黃曲霉毒素B1樣品色譜圖見圖2。

圖1 黃曲霉毒素B1標品色譜圖Fig.1 The chromatogram of the AFB1

圖2 黃曲霉毒素B1樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of the AFB1

以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，黃曲霉毒素B1的濃度為橫坐標，得回歸方程Y=0.074 1X+0.033，R2= 0.9968，黃曲霉毒素B1含量的標準曲線。黃曲霉素B1含量高并且判定系數為0.996 8接近1，說明在0.20μg/L～200.00μg/L范圍內HPLC法所繪制的標準曲線的線性相關性較好。HPLC檢測霉毒素B1的標準曲線見圖3。

圖3 HPLC檢測霉毒素B1的標準曲線Fig.3 HPLC standard curvemethod for thedeterm ination of aflatoxin B1

2.2 HPLC檢測曲霉毒素B1的準確度

黃曲霉毒素B1標液精確吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黃曲霉毒素B1標品溶液20μL重復進樣3次可以計算出相對誤差，見表1。

表1 HPL檢測曲霉毒素B1的準確度Table1 Accuracy of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表1可知HPLC法中各個數據的相對誤差分別是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%均在國家規定的10%以內，說明HPLC法的準確度良好。

2.3 HPLC檢測曲霉毒素B1的系統誤差

該方法的系統誤差用樣品加標回收率試驗來衡量，別為12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黃曲霉毒素標液，添加50μL到5.00 g的苦蕎粉樣品中，制備不同污染程度的樣品，加標樣品經提取、凈化和衍生后，按照HPLC法測定加標樣品中黃曲霉素B1的含量，見表2。

表2 HPLC檢測蕎芯粉中黃曲霉毒素B1的回收率Table2 Determ ination of Tartary Buckwheat core powderrecovery of aflatoxin B1in the rateof HPLCmethod

由表2可知，在12.50μg/L～200.00μg/L范圍內，本方法的加標回收率介于80.20%～89.50%之間，符合技術要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%，說明HPLC法的系統誤差在符合要求內。

2.4 HPLC檢測曲霉毒素B1的精密度

為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的精密度，分別取5.00 g苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶樣品5份，處理后測定黃曲霉毒素B1的含量，計算其變異系數，見表3。

表3 HPLC法檢測黃曲霉毒素B1的精密度Table3 The precision of HPLCm ethod for thedeterm ination ofaflatoxin B1

由表3可知，HPLC測定苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素B1的變異系數分別是9.36%、5.25%、8.22%，國標GB/T17480-2008《食品中黃曲霉毒素B1的測定酶聯免疫吸附法》規定變異系數應小于10%，以上數據均小于10%，說明HPLC法的精密度良好。

2.5 HPLC檢測曲霉毒素B1的靈敏度

先進0μg/L黃曲霉毒素B1標品，測出出峰附近噪

音信號N為0.0015 mAU，再進樣0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黃曲霉毒素B1標品，測出信號S，計算由S/N，見表4。

表4 HPLC檢測黃曲霉毒素B1的靈敏度Table4 Sensitivity of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表4可知，當黃曲霉毒素Bl濃度為0.20μg/L時，色譜峰高為噪音峰高的3倍。因此HPLC的最低檢測濃度為0.20μg/L。

3 討論與結論

本試驗建立了HPLC分析方法的質控參數并對苦蕎制品檢測性能和可靠性作了詳細的分析。結果顯示：HPLC法的繪制標準曲線，判定系數R2=0.996 8接近1，符合檢測要求；在0.20μg/L～200.00μg/L范圍內，苦蕎粉的加標回收率介于80.20%～89.50%之間，符合技術要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%。HPLC測定苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素B1的變異系數分別是9.36%、5.25%、8.22%，小于10%，符合國標GB/T17480-2008《食品中黃曲霉毒素B1的測定酶聯免疫吸附法》規定要求，HPLC法中最低檢測濃度為0.20μg/L。

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The Feasible Discussion about A flatoxin B1Determ ination in Tartary Buckwheat Products by HPLC

LINQiao，GONGFa-yong，XIAOShi-ming
（Buckwheat Laboratory of Xichang College，Xichang 615000，Sichuan，China）

Feasibility ofdeterminingaflatoxin B1in tartary buckwheatproductsby HPLCwas researched by analyzing the standard curve，accuracy，precision，the system error and sensitivity.The results showed thatusing HPLC to determine the aflatoxin B1in tartary buckwheat products，the detection range was 0.20μg/L～200.00μg/L，determination coefficientR2was0.996 8，the relative errorwas7.09%、5.28%、4.55%、0.23% respectively，theaverage recovery ofstandard addition in buckwheatcore flourwas84.58%，the variation coefficientofbuckwheatnoodles，buckwheatsoup and buckwheat teawas9.36%，5.25%，8.22%respectively，and the detection sensitivity reached 0.20μg/L.

HPLC；aflatoxin B1；tartarybuckwheatproducts；methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.034

2016-01-28

四川省教育廳重點科研基金項目（13ZA0157）

林巧（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品品質與安全管理。