成體小鼠心臟Sca-1+細胞體外分化潛能的實驗研究

王 浩， 陳 浩， 張海波， 周春霞

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心心臟外科，上海 200127

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·論 著·

成體小鼠心臟Sca-1+細胞體外分化潛能的實驗研究

王 浩， 陳 浩， 張海波， 周春霞*

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心心臟外科，上海 200127

目的： 研究成體小鼠心臟Sca-1+細胞體外誘導分化的潛能。方法： 利用免疫磁珠分選法分離成體小鼠心臟Sca-1+細胞，通過BMP-2/FGF-4，TGF-β1及VEGF165等三種不同的體外誘導方法使其向心臟“三系”分化，并從細胞形態的變化、RT-PCR和免疫熒光染色等方面鑒定其分化潛能。結果： 經BMP-2/FGF-4誘導，小鼠心臟Sca-1+細胞發生形態改變，上調心肌細胞特征基因α-MHC、β-MHC、MLC-2a和MLC-2v的mRNA表達，同時表達心肌特征性蛋白cTNT和cMHC。經TGF-β1誘導，小鼠心臟Sca-1+細胞亦發生形態改變，上調平滑肌特征基因α-SMA和Calponin的mRNA表達，同時表達平滑肌特征性蛋白SMA、sMHC和Calponin的表達。經VEGF165誘導，小鼠心臟Sca-1+細胞同樣發生了形態改變，上調內皮細胞特征基因CD31、vWF和VE-Cadherin的mRNA表達，同時表達內皮細胞特征性抗原CD31。結論： 成體小鼠心臟Sca-1+細胞在體外多種因素的分別作用下，能向心肌樣細胞、平滑肌樣細胞和內皮樣細胞分化，具有心臟干細胞特性的多向分化潛能。

Sca-1；心臟；干細胞；誘導分化

成體心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)或心肌前體細胞(cardiomyocytes progenitor cells，CMPCs)的發現，拉開了人類心臟組織再生或修復的新序幕。利用自體或同種異體CSCs來修復缺血壞死心肌組織成為近年來研究的熱點[1-3]，也無疑為先天性心臟病患兒構建所需的組織工程心臟補片提供良好的種子細胞[4]。研究發現，作為CSCs家族的重要成員， Sca-1+CSCs是成體心臟組織中居于優勢地位的干細胞，其含量是c-kit+CSCs的100～700倍[5-6]。然另有文獻表明，心臟組織中的Sca-1+細胞多數是內皮細胞[7]，而非CSCs。前期研究中，我們通過免疫磁珠分選法從小鼠心臟組織中成功分離出較高純度的Sca-1+細胞[8]，然而，該群Sca-1+細胞是否就是真正意義上的CSCs或CMPCs呢？我們將通過系列體外誘導分化的實驗來探討其分化潛能，從而判定其細胞學特性，為后期組織工程心臟補片的研究提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 SPF級野生型ICR小鼠，3～4周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

1.1.2 儀器與試劑 MiniMACS磁珠分選器(Miltenyi Biotech)，MiniMACS磁珠分選柱(Miltenyi Biotech)，熒光倒置顯微鏡(Leica)，PCR儀(BioRad)。小鼠抗Sca-1-FITC 單克隆磁珠抗體(Miltenyi Biotech)；重組人骨形態發生蛋白-2(BMP2)，重組人成纖維細胞生長因子-4(FGF4)，重組人轉化生長因子-β1(TGF-β1)，重組小鼠血管內皮細胞生長因子-165(VEGF165)均購自PeproTech；小鼠抗心肌MHC單克隆一抗，兔抗小鼠平滑肌MHC多克隆一抗，兔抗小鼠Calponin-1單克隆一抗均購自Abcam；大鼠抗小鼠CD31-生物素，鏈霉親和素-PE購自eBioscience；山羊抗小鼠心肌Troponin T多克隆一抗(Santa Cruz)；兔抗小鼠平滑肌α-Actin單克隆一抗(Epitomics)；TRIzol(Invitrogen)；PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRaTaq試劑盒購自TaKaRa。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠心臟Sca-1+細胞的分離提取和原代培養 利用膠原酶A消化小鼠心臟組織成單細胞懸液，再用免疫磁珠分選法篩選提取其中的Sca-1+細胞，按1×104/cm2將Sca-1+細胞接種于0.1%明膠包被的24孔培養板，加入生長培養液[9]，37℃、5%CO2中靜置培養3 d。此后每3 d換培養液一次，待細胞生長至80%～90%匯合時消化傳代。

1.2.2 小鼠心臟Sca-1+細胞體外誘導分化 經傳代擴增的P4代Sca-1+細胞按1×104/cm2接種于6孔培養板中，37℃，5% CO2中靜置培養，達70%～80%融合時開始誘導分化。

向心肌樣細胞分化：棄原培養液，加入BMP2/FGF4(濃度100 ng/mL)誘導分化液， 37℃，5%CO2中避光培養；設立對照組(僅不含BMP-2/FGF-4)。誘導24 h，更換為普通培養液繼續培養，每3 d換液一次，培養2周。

向平滑肌樣細胞分化：棄原培養液，加入TGF-β1(濃度10 ng/mL)誘導分化液，37℃，5% CO2中培養；設立對照組(僅不含TGF-β1)。誘導組每3 d更換誘導液1次，對照組每3 d更換培養液1次，培養10 d。

向內皮樣細胞分化：棄原培養液，加入VEGF165(濃度20 ng/mL)誘導分化液，37℃，5% CO2中培養；設立對照組(僅不含VEGF165)。誘導組每3 d更換誘導液1次，對照組每3 d更換培養液1次，培養2周。

表1 PCR引物序列

1.2.3 誘導分化后鑒定 細胞免疫熒光染色：誘導后，誘導組和對照組細胞予以PBS漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗5 min×3次，0.3%TritonX-100透壁處理20 min(CD31染色除外)，血清封閉30 min，去封閉血清，添加一抗，4℃孵育過夜，PBS漂洗5 min×3次，添加二抗，室溫避光孵育60 min，PBS漂洗5 min×3次，1∶1 000的DAPI染核1～2 min，PBS漂洗5 min×3次，鏡下觀察拍照。

RT-PCT檢測：誘導后，用TRIzol法抽提總RNA，同型小鼠的心肌組織設為陽性對照。利用PrimeScript反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA；利用Takara Taq PCR試劑盒行PCR擴增。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性1 min，退火40 s，72℃延伸50 s，30～32 cycles，72℃終末延伸7 min。使用2%的瓊脂糖凝膠電泳30～35 min后，凝膠成像系統檢測拍照。GAPDH為內參。

2 結 果

2.1 小鼠心臟Sca-1+細胞體外向心肌樣細胞分化 鏡下顯示，P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞在BMP-2/FGF-4作用24 h后雖然細胞大小形態相仿，但折光性增強，并開始呈一定趨向性排列(圖1B)。誘導1周后，大部分細胞呈長梭形，折光性強，明顯的趨向性排列(圖1C)。誘導2周后，細胞生長甚密，仍表現出較強折光性，但未見自發跳動的細胞(圖1D)。而同期對照組細胞，形態梭形改變，無趨向性排列，折光性較弱(圖1E-G)。免疫熒光染色發現，經誘導后部分Sca-1+細胞表達心肌特征性結構蛋白cTNT和cMHC，而對照組沒有表達(圖2)。RT-PCR結果同樣發現，與對照組相比，經誘導的Sca-1+細胞明顯上調α-MHC、β-MHC、MLC-2a和MLC-2v等成熟心肌特異基因的mRNA表達(圖3)。雖然在誘導分化2周后仍然沒有發現這些細胞發生自發的有節律搏動或者是簡單的搏動，但上述結果仍然提示我們，BMP-2/FGF-4能誘導成體小鼠心臟Sca-1+細胞向心肌樣細胞分化，反過來也說明成體小鼠心臟Sca-1+細胞具有向心肌細胞分化的潛能。

2.2 小鼠心臟Sca-1+細胞體外向平滑肌樣細胞分化 鏡下發現，P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞在TGF-β1作用24 h后發生了形態學的改變，細胞變長呈梭形，折光性明顯增強，且具明顯的趨向性排列，類似于“波峰-波谷”樣特征(圖4A)。誘導10 d后，細胞重疊生長，仍呈梭形改變，折光性強，但排列不規律(圖4B)。而同期對照組細胞形態上沒有明顯改變(圖4C、4D)。免疫熒光染色同樣發現，經誘導的Sca-1+細胞表達平滑肌細胞特征性蛋白SMA、sMHC和Calponin較對照組明顯增強(圖5)。RT-PCR結果亦顯示，與對照組相比，經誘導的Sca-1+細胞明顯上調平滑肌特異基因α-SMA和Calponin的mRNA表達(圖6)。上述結果提示，TGF-β1能有效誘導成體小鼠心臟Sca-1+細胞向平滑肌樣細胞分化。換言之，成體小鼠心臟Sca-1+細胞具有向平滑肌細胞分化的潛能。

圖1 BMP-2/FGF-4誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+ 細胞成心肌細胞分化的光鏡下形態

A: 誘導前Sca-1+細胞的形態；B-D: BMP-2/FGF-4誘導后細胞在不同時間點的形態特征；E-G: 對照組在上述不同時間點同期的細胞形態。放大倍率 ×100

圖2 BMP-2/FGF-4誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+ 細胞成心肌細胞分化的免疫熒光染色鑒定

A: cTNT熒光染色結果(cTNT，綠色；DAPI，藍色)；B: cMHC熒光染色結果(cMHC，綠色；DAPI，藍色). 白色箭頭所指為特異的陽性染色，放大倍率 ×400

圖3 BMP-2/FGF-4誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+

RT-PCR檢測心肌特異性轉錄因子GATA4、Nkx2.5和MEF2C，心肌細胞特征基因α-MHC、β-MHC、MLC-2a和MLC-2v的mRNA表達. GAPDH為內參

2.3 小鼠心臟Sca-1+細胞體外向內皮樣細胞分化 鏡下觀察，P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞在VEGF165誘導24 h后亦發生了改變，細胞生長緩慢，大部分伸出偽足，但胞體大小形態沒有明顯改變，折光性有增強(圖7B)。誘導1周后，細胞生長密集，偽足漸退，形態以梭形為主，折光性強(圖7C)。誘導2周后，細胞生長甚密，仍表現出較強折光性，偽足消失，形態以卵圓形為主(圖7D)。而對照組細胞無明顯改變，無偽足形成(圖7E-G)。免疫熒光染色顯示，經誘導后部分Sca-1+細胞能夠表達內皮細胞特征性抗原CD31，而對照組沒有表達(圖8)。RT-PCR結果同樣發現，與對照組相比，經誘導的Sca-1+細胞能明顯上調內皮細胞特異性基因CD31、vWF和VE-Cadherin的mRNA表達(圖9)。上述結果提示，成體小鼠心臟Sca-1+細胞在VEGF165的誘導下具有向內皮細胞分化的潛能。

圖4 TGF-β1誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞成平滑肌細胞分化的光鏡下形態

A-B: TGF-β1誘導后細胞在不同時間點的形態特征；C-D: 對照組在上述不同時間點同期的細胞形態. 放大倍率 ×100

圖5 TGF-β1誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+ 細胞成平滑肌細胞分化的免疫熒光染色鑒定

A: SMA熒光染色結果(SMA，綠色；DAPI，藍色)；B: sMHC熒光染色結果(sMHC，綠色；DAPI，藍色)；C: Calponin熒光染色結果(Calponin，綠色；DAPI，藍色). 放大倍率 ×100

圖6 TGF-β1誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞成平滑肌細胞分化的特異基因表達

RT-PCR檢測平滑肌細胞特征基因SMA、Calponin的mRNA表達. Induced：TGF-β1誘導組；Control：非誘導對照組；GAPDH為內參；mH：mouse heart

圖7 VEGF165誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞成內皮細胞分化的光鏡下形態

A: 誘導前Sca-1+細胞的形態；B-D: VEGF165誘導后細胞在不同時間點的形態特征；E-G: 對照組在上述不同時間點同期的細胞形態. 放大倍率 ×100

圖8 VEGF165誘導P4代成體小鼠心臟Sca-1+細胞成內皮細胞分化的免疫熒光染色鑒定

CD31熒光染色結果(CD31，紅色；DAPI，藍色). 放大倍率 ×100

圖9 VEGF165誘導P4代成體小鼠Sca-1+細胞成內皮細胞分化的基因表達檢測

RT-PCR檢測內皮前體標志Flk-1，內皮細胞特征基因CD31、vWF和VE-Cadherin的mRNA表達. GAPDH為內參

3 討 論

經過體外誘導分化實驗我們發現，在BMP-2/FGF-4的聯合作用下，成體小鼠心臟組織來源的Sca-1+細胞能夠表達成熟心肌的特征基因α-MHC、β-MHC、MLC-2a及MLC-2v，而且還表達心肌特征性結構蛋白cTNT和cMHC。在TGF-β1的作用下，該群細胞能夠上調平滑肌特征基因α-SMA和Calponin的表達，而且還表達平滑肌特征性蛋白SMA、sMHC和Calponin。同時，在VEGF165的作用下，內皮細胞特征基因CD31、VE-cadherin、vWF及表面抗原CD31都有明顯表達。因此，我們可以基本判定從成體小鼠心臟組織中篩選出來的Sca-1+細胞為CSCs，具有向心肌、平滑肌、內皮等心臟“三系”分化的多向分化潛能。這與Wang等人的研究發現是一致的，他們通過建立小鼠心肌梗死模型發現，在心梗發生的早期，梗死周邊區域的Sca-1+細胞數量顯著上升，而骨髓和血液中的Sca-1+細胞數量無論在心梗早期還是晚期都沒有明顯變化[10]，這說明在成體心臟組織中可能駐守著自身固有的Sca-1+細胞。研究還發現，Sca-1+細胞可以在心梗的環境中向內皮和心肌細胞分化，通過促進局部血管和心肌的再生來改善心梗后的心臟功能。

實驗的結果是可喜的，但也存有遺憾與不足，我們在心肌的誘導效率方面還不滿意。Sca-1+CSCs不僅未能分化為有收縮功能的成熟心肌細胞，而且表達心肌特征蛋白cMHC或cTNT的細胞比例也很少。尋找高效的誘導方法一直是干細胞再生醫學領域里的熱點之一。考慮到干細胞實際分化成熟過程中的復雜性，僅依靠某一誘導因子或多個因子的簡單聯合，往往很難實現向心肌細胞這類具有復雜結構和特殊生理功能的細胞去成熟分化，即使可能，效率也是極低的[11]。有研究人員為了模擬心肌分化成熟過程中所需的復雜條件，先在體外分離培養心肌細胞，再與干細胞或前體細胞共培養，利用前者可能分泌的細胞因子來促使后者向成熟心肌分化。然而，這也不一定能實現干細胞向自發搏動的成熟心肌細胞轉變[12-14]。也有研究將CMPCs或CSCs直接移植到梗死心肌的缺血區域，雖然有向成熟心肌分化的可能，但是移植細胞的留存率低[15-16]，從而使得總體的轉化率下降。

當然，除了給予的誘導條件和生長環境外，干細胞自身的特性可能也是影響分化效率的重要因素之一。就CMPCs來說，van等人研究發現，相比胚胎期CMPCs的多向分化能力，成體CMPCs更傾向于定向心肌的分化，而且由后者分化而來的心肌樣細胞具有更好的電生理功能[17]，說明雖然胚胎期CMPCs具有多向分化的能力，但其成心肌分化的效率可能反不如定向心肌分化的成體CMPCs。另有文獻表明，具有多向分化能力的干細胞更接近于原始細胞，從而遠離分化成熟的細胞[18]。同樣，我們實驗中的Sca-1+CSCs亦具有多向分化的潛能，可能相比定向心肌分化的成體CMPCs更具原始特性，從而向成熟心肌的分化亦相對困難。當然，對于心肌梗死的治療或組織工程心臟的構建而言，絕不僅僅是成熟心肌細胞的堆砌，CSCs因其具有向心臟“三系”的多向分化潛能而擁有巨大的臨床應用價值，目前已經被全球多個中心運用到Ⅰ期的臨床試驗中[1-3]。然而，要真正實現對梗死心肌組織結構和功能的生理修復，最重要的還是要找到合適的體外培養體系和高效的誘導條件，使CSCs或CMPCs能夠朝著具有完全生理功能的成熟心肌或心臟細胞去分化，這也是我們未來工作中所需探討和深入研究的問題。

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[本文編輯] 葉 婷， 賈澤軍

Experimental study on the differentiation potential of Sca-1-positive cells from adult mouse heart in vitro

WANG Hao, CHEN Hao, ZHANG Hai-bo, ZHOU Chun-xia*

Department of Cardiac Surgery, Shanghai Children’s Medical Center, Shanghai 200127, China

Objective： To study the differentiation potential of Sca-1+cells from adult mouse heart in vitro. Methods： We isolate Sca-1+cells derived from mouse heart by means of immunomagnetic cell sorting. By using three different kinds of differentiation inducing factors, including BMP-2/FGF-4, TGF-β1 and VEGF165, to induce Sca-1+cells to differentiated into the heart "three lines"invitro. The differentiation potential of the cells was identified from the changes of cell morphology, RT-PCR and immunofluorescence staining. Results： After BMP-2/FGF-4 induction, the mouse cardiac Sca-1+cells underwent morphological changes, up regulation of the mRNA expression of α-MHC, β-MHC, MLC-2a and MLC-2v, and the protein expression of cTNT and cMHC, which were the specific markers of cardiomyocytes. After TGF-β1 induction, these Sca-1+cells also had morphological changes, up regulation of mRNA expression of α-SMA and Calponin, and the protein expression of SMA, sMHC, and Calponin, which were the specific markers of smooth muscle cells. After VEGF165induction, the Sca-1+cells also underwent morphological changes, up regulation of endothelial cell specific gene CD31, vWF, and VE-Cadherin expression, and the expression of endothelial cell specific antigen CD31. Conclusions： Adult mouse cardiac Sca-1+cells can differentiate into cardiomyocyte-like cells, smooth muscle-like cells and endothelial-like cells under different inducing factors in vitro，which suggest these cells have multi-lineage differentiation potential as cardiac stem cells.

Sca-1; heart; stem cells; induced differentiation

2016-09-07 [接受日期] 2016-10-15

上海市浦東新區科技發展基金創新資金資助項目(PKJ2013-Y64). Supported by Pudong New Area Science and Technology Development Fund Innovative Foundation Projects of Shanghai (PKJ2013-Y64).

王 浩，博士，主治醫師. E-mail: haowang_nt@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-38626161, E-mail: zcxaparis@yahoo.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160935

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