血清天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶表達與肝細胞癌術后患者預后的關系研究

張繼宗，胡 亮，韓建波，易永祥

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·論著·

血清天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶表達與肝細胞癌術后患者預后的關系研究

張繼宗，胡 亮，韓建波，易永祥

目的 探討血清天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶(ASPH)表達與肝細胞癌(HCC)術后患者復發或死亡的關系。方法 選取2010年6月—2011年1月于東南大學附屬南京市第二醫院肝膽外科收治的HCC患者96例為研究對象，記錄患者病理分級、腫瘤直徑、肝纖維化病理分期、TNM分期，以及有無門靜脈癌栓、微血管浸潤，檢測入院時清蛋白、總膽紅素水平。檢測術前甲胎蛋白(AFP)、高爾基體蛋白73(GP73)，以及術前及術后1周、1個月、2個月ASPH水平。以手術時間為觀察起點隨訪5年，以腫瘤復發或死亡為觀察終點事件。分別采用Log-rank檢驗、多因素Cox比例風險回歸模型分析HCC術后患者預后的影響因素。結果 HCC患者術前及術后1周、1個月、2個月ASPH水平分別為(128.3±19.3)、(91.2±16.2)、(33.7±9.4)、(22.4±5.7)ng/L，術后2個月患者ASPH水平均在參考范圍內。單因素分析顯示，不同腫瘤直徑、TNM分期，有無門靜脈癌栓、微血管浸潤，以及不同術前ASPH表達的HCC術后患者復發或死亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，TNM分期〔HR=1.378，95%CI(1.124，1.842)〕、門靜脈癌栓〔HR=1.260，95%CI(1.012，1.356)〕、微血管浸潤〔HR=1.583，95%CI(1.144，2.652)〕、術前ASPH表達〔HR=1.475，95%CI(1.875，2.011)〕是HCC術后患者復發或死亡的影響因素(P<0.05)。結論 術前ASPH表達是HCC術后患者復發或死亡的獨立影響因素，可作為判斷HCC術后患者預后的潛在指標。

癌，肝細胞；天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶；腫瘤復發；預后

張繼宗，胡亮，韓建波，等.血清天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶表達與肝細胞癌術后患者預后的關系研究[J].中國全科醫學，2016，19(35)：4350-4353.[www.chinagp.net]

ZHANG J Z， HU L， HAN J B，et al.Correlation between serum aspartate beta-hydroxylase and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma after surgery[J].Chinese General Practice，2016，19(35)：4350-4353.

目前，甲胎蛋白(AFP)廣泛應用于臨床肝細胞癌(HCC)的診斷，但30%～40%的HCC患者AFP水平處于參考范圍內，AFP診斷HCC的靈敏度有待進一步提高[1-2]。既往研究發現，天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶(ASPH)可作為新的腫瘤標志物，其聯合AFP對HCC進行篩查及診斷具有一定的價值[3]，但ASPH在預測HCC術后患者預后的價值尚不明確。本研究檢測HCC術后患者ASPH水平，并通過5年的隨訪，分析ASPH表達預測HCC術后患者預后的價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年6月—2011年1月于東南大學附屬南京市第二醫院肝膽外科收治的HCC患者96例為研究對象，其中男64例，女32例；年齡31～72歲，平均年齡(53.4±7.2)歲；Child-Pugh分級A級78例，B級18例；均伴有乙型肝炎病毒感染史及肝硬化。納入標準：(1)符合HCC診斷標準[4]，且為初次診斷，既往未行任何治療；(2)完整切除腫瘤，術后切緣陰性。患者均簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 記錄性別、年齡、病理分級、腫瘤直徑、肝纖維化病理分期、TNM分期，以及有無門靜脈癌栓、微血管浸潤，檢測入院時清蛋白、總膽紅素水平。肝纖維化病理分期依據1995年中華醫學會肝病分會肝纖維化分期標準，根據纖維沉積部位、范圍及對肝結構破壞程度、微循環影響的大小進行肝纖維化炎癥活動度(G)和纖維化程度(S)分級，G1～2，S0～2為輕度；G3，S1～3為中度；G4，S2～4為重度[4]。

1.2.2 AFP、高爾基體蛋白73(GP73)及ASPH水平檢測 檢測術前AFP、GP73水平，檢測術前及術后1周、1個月、2個月ASPH水平。分別于術前及術后1周、1個月、2個月抽取空腹外周靜脈血5 ml，用促凝管將分離的血清存儲于4 ℃冰箱。AFP水平檢測采用i2000發光分析儀及配套試劑，GP73及ASPH水平檢測采用定量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法，試劑盒由上海信然實業有限公司提供，檢測方法按照說明書操作進行。ASPH水平>32.4 ng/L為表達陽性。

1.2.3 隨訪 以手術時間為觀察起點隨訪5年，術后半年內每個月復查肝功能、血常規、腹部超聲或CT平掃加增強，半年后每4個月復查一次，復查時間間隔不超過6個月，以腫瘤復發或死亡為觀察終點事件。

2 結果

2.1 ASPH水平變化 HCC患者術前及術后1周、1個月、2個月ASPH水平分別為(128.3±19.3)、(91.2±16.2)、(33.7±9.4)、(22.4±5.7)ng/L，術后2個月患者ASPH水平均在參考范圍內。

2.2 單因素分析 不同性別、年齡、病理分級、肝纖維化病理分期、入院時清蛋白、總膽紅素、術前AFP、GP73水平的HCC術后患者復發或死亡率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。不同腫瘤直徑、TNM分期，有無門靜脈癌栓、微血管浸潤，以及不同術前ASPH表達的HCC術后患者復發或死亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05,見表1)。

2.3 多因素Cox比例風險回歸模型分析 以HCC術后患者臨床特征為自變量，以是否出現復發或死亡為因變量行多因素Cox比例風險回歸模型分析，變量賦值見表2。結果顯示，TNM分期、門靜脈癌栓、微血管浸潤、術前ASPH表達是HCC術后患者復發或死亡的影響因素(P<0.05，見表3)。

表1 不同臨床特征的HCC術后患者預后比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of prognosis among HCC patients after surgery with different clinical features

臨床特征例數無復發復發或死亡χ2值P值性別<0.001>0.05 男649(14.1)55(85.9) 女326(18.8)26(81.2)年齡(歲)0.0670.795 <50579(15.8)48(84.2) ≥50396(15.4)33(84.6)病理分級0.8310.362 中低分化6410(15.6)54(84.4) 高分化325(15.6)27(84.4)腫瘤直徑(cm)35.535<0.001 <2258(32.0)17(68.0) 2～5476(12.8)41(87.2) >5241(4.2)23(95.8)肝纖維化病理分期0.9640.617 輕度122(16.7)10(83.3) 中度559(16.4)46(83.6) 重度294(13.8)25(86.2)TNM分期(期)23.650<0.001 Ⅰa+Ⅰb259(36.0)16(64.0) Ⅱa184(22.2)14(77.8) Ⅱb221(4.5)21(95.5) Ⅲ311(3.2)30(96.8)門靜脈癌栓23.982<0.001 無6515(23.1)50(76.9) 有314(12.9)27(87.1)微血管浸潤9.4970.002 無5511(20.0)44(80.0) 有414(9.8)37(90.2)入院時清蛋白(g/L)2.7820.095 <35254(16.0)21(84.0) ≥357111(15.5)60(84.5)入院時總膽紅素(μmol/L)0.1180.731 <19.0696(8.7)63(91.3) ≥19.0279(33.3)18(66.7)術前AFP(μg/L)0.7540.385 <8.78245(20.8)19(79.2) ≥8.787210(13.9)62(86.1)術前GP73(μg/L)0.0130.909 <150144(28.6)10(71.4) ≥1508211(13.4)71(86.6)術前ASPH23.669<0.001 陰性2113(61.9)8(38.1) 陽性752(2.7)73(97.3)

注：AFP=甲胎蛋白，GP73=高爾基體蛋白73，ASPH=天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶

表2 HCC術后患者復發或死亡影響因素的多因素Cox比例風險回歸模型分析變量賦值表

Table 2 Variable assignment of multivariate Cox proportional hazards regression model analysis on influencing factors for the recurrence or death of HCC patients after surgery

變量賦值性別男=1,女=2年齡(歲)<50=1,≥50=2病理分級中低分化=1,高分化=2腫瘤直徑(cm)<2=1,2～5=2,>5=3肝纖維化病理分期輕度=1,中度=2,重度=3TNM分期(期)Ⅰa+Ⅰb=1,Ⅱa=2,Ⅱb=3,Ⅲ=4門靜脈癌栓無=0,有=1微血管浸潤無=0,有=1入院時清蛋白(g/L)<35=1,≥35=2入院時總膽紅素(μmol/L)<19.0=1,≥19.0=2術前AFP(μg/L)<8.78=1,≥8.78=2術前GP73(μg/L)<150=1,≥150=2術前ASPH陰性=1,陽性=2復發或死亡否=0,是=1

表3 HCC術后患者復發或死亡影響因素的多因素Cox比例風險回歸模型分析

Table 3 Multivariate Cox proportional hazards regression model analysis on influencing factors for the recurrence or death of HCC patients after surgery

變量βSEWaldχ2值P值HR(95%CI)性別0.0180.0131.8630.1721.018(0.992,1.045)年齡0.0340.2450.0190.8911.034(0.640,1.673)病理分級-0.6860.6171.2360.2660.504(0.150,1.687)腫瘤直徑-1.3980.7353.4210.0640.247(0.056,1.087)肝纖維化病理分期0.5230.6980.5620.4541.688(0.429,6.632)TNM分期0.3210.1834.8720.0181.378(1.124,1.842)門靜脈癌栓0.2310.0787.2170.0071.260(1.012,1.356)微血管浸潤0.4590.2633.0380.0411.583(1.144,2.652)入院時清蛋白-0.3600.2781.6660.1970.698(0.404,1.205)入院時總膽紅素-0.0170.0180.9260.3360.983(0.949,1.018)術前AFP0.2010.3266.2890.1221.223(0.035,1.862)術前GP730.6870.4632.2600.1331.987(0.809,4.976)術前ASPH0.3890.1695.1290.0241.475(1.875,2.011)

3 討論

ASPH是哺乳動物胚胎期即存在于細胞內的一種依賴α-酮戊二酸的脫氧酶，其主要生物學功能是在翻譯后的蛋白修飾過程中催化某些蛋白中表皮生長因子樣結構域天冬酰胺殘基β碳原子的羥基化反應。ASPH及其主要的剪切異構體humbug作為惡性腫瘤相關抗原，不僅在膽管癌及HCC中高表達，而且在肺癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤細胞中也有高表達[4-8]。因此，有研究提出ASPH可作為肝癌及其他癌癥發生的標志物和治療靶點，是一種潛在的廣譜性腫瘤標志物[7-10]。目前，國內外關于ASPH在HCC方面的基礎及臨床研究報道尚少。既往研究發現，聯合檢測ASPH及GP73診斷HCC的靈敏度為88.0%，特異度為97.0%，正確率為94.0%，均高于AFP，極大提高了HCC的診斷正確率，避免了誤診、漏診[3]。本研究發現，HCC患者ASPH表達陽性率為78.1%(75/96)，與既往報道[11]一致。

有研究發現，ASPH表達陽性HCC患者腫瘤細胞更具有侵襲性[8]，腫瘤組織越大，釋放到外周血中ASPH越多，則有助于早期診斷HCC。雖然部分患者未出現門靜脈癌栓，但可能已經出現微血管浸潤，其高表達的ASPH更易被釋放至外周循環中。本研究發現，HCC患者術前及術后1周、1個月、2個月ASPH水平逐漸下降，術后2個月時ASPH水平均在參考范圍內；多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示，術前ASPH表達是HCC術后患者復發或死亡的獨立影響因素。筆者認為，HCC細胞分泌ASPH后，其在外周血中水平增高的同時，在HCC微環境中也參與腫瘤細胞增生，而且增強了腫瘤細胞的侵襲性及轉移性，引發惡性循環[9-11]。該結論對早期監測HCC復發及轉移有重要的臨床意義，術后隨訪可聯合檢測患者外周血中ASPH、AFP以及GP73表達，判斷患者預后情況，達到早期預警目的。

綜上所述，術前ASPH表達是HCC術后患者復發或死亡的獨立影響因素，可作為判斷HCC術后患者預后的潛在指標。由于ASPH與各種腫瘤關系的基礎及臨床研究較少，故ASPH對HCC發生、發展的具體作用機制尚需進一步探討。

作者貢獻：張繼宗負責課題設計與實施、評估、資料收集整理、成文并對文章負責；胡亮、韓建波負責資料收集整理；易永祥負責課題設計與實施、質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]ZHU K，DAI Z，ZHOU J.Biomarkers for hepatocellular carcinoma:progression in early diagnosis，prognosis，and personalized therapy[J].Biomark Res，2013，1(1):10.

[2]TATEISHI R，ENOOKU K，SHIINA S，et al.Tumor markers for hepatocellular carcinoma[J].Nihon Rinsho，2012，70(5):821-827.

[3]張繼宗，孟九大，丁海，等.血清天冬氨酸-天冬酰胺β羥化酶(ASPH)分子聯合AFP和GP73檢測對原發性肝癌的診斷意義[J].山東大學學報(醫學版)，2014，6(52)：78-80. ZHANG J Z，MENG J D，DING H，et al.Diagnostic value of aspartate beta-hydroxylase combined with AFP and GP73 for hepatocellular carcinoma[J].Journal of Shandong University (Health Science) ，2014，6(52)：78-80.

[4]袁平戈,周衛平.酒精性肝病及肝纖維化學術研討會紀要[J].中華肝臟病雜志,1995，3(4)：196. YUAN P G，ZHOU W P.Summary of the symposium on alcoholic liver disease and liver fibrosis[J].Chinese Journal of Hepatology,1995，3(4)：196.

[5]YEUNG Y A，FINNEY A H，KOYRAKH I A，et al.Isolation and characterization of human antibodies targeting human aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase[J].Hum Antibodies，2007，16(3/4)：163-176.

[6]YANG H，WANG H，XUE T，et al.Single-chain variable fragment antibody against human aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase expressed in recombinant Escherichia coli[J].Hybridoma (Larchmt)，2011，30(1)：69-79.

[7]YANG H，SONG K，XUE T，et al.The distribution and expression profiles of human aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase in tumor cell lines and human tissues[J].Oncol Rep，2010，24(5)：1257-1264.

[8]WANG K，LIU J，YAN Z L，et al.Overexpression of aspartyl-(asparaginyl)-beta-hydroxylase in hepatocellular carcinoma is associated with worse surgical outcome[J].Hepatology，2010，52(1)：164-173.

[9]宋凱，薛小平，王偉，等.ASPH在腫瘤細胞和腫瘤組織中的分布及檢測[J].細胞與分子免疫學雜志，2010，26(2):141-144. SONG K,XUE X P,WANG W,et al.The distribution and expression pro-files of aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase(ASPH)in some tumorous cell lines and tissues[J].Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2010，26(2):141-144.

[10]YANG H，LI J，TANG R，et al.The aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase in carcinomas[J].Front Biosci (Landmark Ed) ，2015，20(5)：902-909.

[11]GUNDOGAN F，BEDOYA A，GILLIGAN J，et al.SiRNA inhibition of aspartyl-asparaginyl β-hydroxylase expression impairs cell motility，Notch signaling，and fetal growth[J].Pathol Res Pract，2011，207(9):545-553.

(本文編輯：吳立波)

Correlation between Serum Aspartate Beta-hydroxylase and Prognosis of Patients with Hepatocellular Carcinoma after Surgery

ZHANGJi-zong，HULiang，HANJian-bo，YIYong-xiang.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanjingSecondHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity,Nanjing210003,China

Correspondingauthor：YIYong-xiang,DepartmentofHepatobiliarySurgery,NanjingSecondHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity,Nanjing210003,China；E-mail：supercell@163.com

Objective To investigate the correlation between serum aspartate beta-hydroxylase(ASPH) and recurrence or death of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) after surgery.Methods 96 HCC patients after surgery who were treated in Department of Hepatobiliary Surgery in Nanjing Second Hospital Affiliated to Southeast University from June 2010 to January 2011,were selected as study subjects.The pathological grading,tumor diameter,pathological stage of liver fibrosis,TNM staging,presence of portal vein tumor thrombus and microvascular invasion of patients were recorded,levels of albumin and total bilirubin after admission were detected.Levels of AFP,GP73 and ASPH were detected before surgery,level of ASPH was detected 1 week,1 month and 2 months after surgery respectively.The patients were followed up for 5 years since surgery，and endpoints were recurrence or death.Log-rank test and multivariate Cox proportional hazard regression model were used to analyze the influencing factors of the prognosis of HCC patients after surgery.Results ASPH express level of HCC patients before surgery,1 week,1 month and 2 months after surgery was(128.3±19.3) ng/L,(91.2±16.2) ng/L,(33.7±9.4) ng/L,and (22.4±5.7)ng/L respectively,ASPH level of HCC patients 2 months after surgery was within the reference range.According to univariate analysis results,there were significant differences in incidence of recurrence or death among HCC patients after surgery with different tumor diameter,TNM staging,ASPH express level before surgery,between patients with portal vein tumor thrombus or not,between patients with microvascular invasion or not(P<0.05).According to results of multivariate Cox proportional hazard regression model,TNM staging 〔HR=1.378，95%CI(1.124，1.842)〕,portal vein tumor thrombus〔HR=1.260，95%CI(1.012，1.356)〕,microvascular invasion 〔HR=1.583，95%CI(1.144，2.652)〕,and ASPH express level 〔HR=1.475，95%CI(1.875，2.011)〕 were the influencing factors of recurrence or death of HCC patients after surgery(P<0.05).Conclusion ASPH express is an independent factor influencing recurrence or death of HCC patients after surgery,which can be used as a potential indicator for judging the prognosis of postoperative patients with HCC.

Carcinoma,hepatocellular； Aspartate beta-hydroxylase； Neoplasm recurrence； Prognosis

江蘇省第四期“333工程”項目(20140522)；“十二五”南京市醫學科技發展重大項目(20130231)

210003江蘇省南京市，東南大學附屬南京市第二醫院肝膽外科

易永祥，210003江蘇省南京市，東南大學附屬南京市第二醫院肝膽外科；E-mail：supercell@163.com

R 730.261

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.35.y04

2016-03-10；

2016-08-31)