L-蘋果酸及蘋果對睡眠剝奪小鼠記憶的影響

盧超銀，沈雨莎，張燁，倪燁欽，印媛君

1.浙江中醫藥大學第二臨床學院，浙江杭州310053；2.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江杭州310053

L-蘋果酸及蘋果對睡眠剝奪小鼠記憶的影響

盧超銀1，沈雨莎1，張燁1，倪燁欽1，印媛君2

1.浙江中醫藥大學第二臨床學院，浙江杭州310053；2.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江杭州310053

目的探討不同濃度L-蘋果酸以及蘋果對睡眠剝奪小鼠學習記憶的影響。方法15只小鼠隨機分為對照組（ICR+生理鹽水組）和實驗組（ICR+高、中、低濃度L-蘋果酸組，ICR+蘋果組）。用Morris水迷宮測出睡眠剝奪前后小鼠的空間學習記憶。結果ICR+高濃度L-蘋果酸組學習記憶并沒有明顯改善；ICR+中、低濃度L-蘋果酸組學習記憶明顯改善；ICR+蘋果汁組學習記憶得到明顯改善，且效果優于ICR+中、低濃度L-蘋果酸組。結論適當濃度的L-蘋果酸和蘋果都能夠起到改善學習記憶的作用，但是蘋果改善學習記憶的機制是否僅同L-蘋果酸相關還需要進一步的研究。

睡眠剝奪；L-蘋果酸；蘋果；學習記憶

睡眠是維持人類許多生理功能穩態所必需的，睡眠對記憶的形成、存儲等都具有重要的作用[1-3]。睡眠剝奪是指人因環境的需要喪失了所需睡眠量的狀態[4]。隨著現代社會的高速發展，生活節奏的日益加快，人們持續性工作的狀態愈來愈普遍，繼而導致了剝奪的睡眠量增加。睡眠剝奪或者睡眠抑制可引起學習記憶的損害，這一點已有廣泛的研究證實[3,5-8]。鄧龍祥等人的研究中[10]指出蘋果中的L-蘋果酸能改善睡眠剝奪的小鼠學習記憶能力。但是不同濃度的蘋果酸對小鼠睡眠剝奪后空間學習記憶具體影響的不同并未有進一步的研究。且成熟的蘋果中含有一定量的L-蘋果酸，蘋果對小鼠是否也同樣能夠起到改善睡眠剝奪后學習記憶的作用也未見研究。該實驗擬通過研究L-蘋果酸以及蘋果對睡眠剝奪后大鼠學習記憶的影響，以對上述內容做進一步的探究。

1　資料和方法

1.1實驗動物和分組

選用健康成年ICR小鼠17只，體重(20±2)g(浙江中醫藥大學實驗動物中心提供)。經Morris水迷宮訓練之后，篩選出成績相近的小鼠15只，隨機分為5組，每組3只。對照組：ICR+生理鹽水組；實驗組：ICR+高濃度（0.7 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR+中濃度（0.35 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR+低濃度（0.175 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR +蘋果汁組（蘋果汁為直接榨取蘋果而來，未添加其他物品）。

1.2藥品與儀器

Morris水迷宮(浙江中醫藥大學實驗動物中心提供)，L-蘋果酸(藥品源自常茂生物化學工程有限公司，純度為99.86%)，灌胃針等。

1.3睡眠剝奪模型的建立

實驗人員于Morris水迷宮訓練后一天的8:00至次日8:00這段時間內監測小鼠的活動情況，阻止小鼠入睡，以達到對小鼠進行睡眠剝奪的目的。

1.4給藥

從睡眠剝奪期間開始給藥，睡眠剝奪期間于下午17：00對實驗組和對照組同時按0.4mL的劑量灌胃。睡眠剝奪之后，依然按分組于每天下午17：00進行灌胃，劑量同睡眠剝奪期間一樣，1次/d，連續進行5 d。

1.5學習記憶的測試

用Morris水迷宮法進行小鼠學習記憶的測試。睡眠剝奪前對小鼠進行水迷宮學習訓練。訓練時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，采集控制儀自動記錄小鼠的路線。小鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s，然后進行下一次的訓練。每只小鼠從四個入水點分別放入水池為一輪訓練，訓練4輪，共訓練16次。訓練成功的標志是小鼠已經形成一定的尋找平臺的路線。淘汰訓練未成功的小鼠，本實驗15只小鼠訓練成功，淘汰2只。對小鼠進行連續5 d灌胃后進行水迷宮測量一次。測量時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入，反應時(s)取平均數，作為測試成績，若小鼠60 s內未找到平臺，則以60 s計。

1.6統計方法

2　結果

將實驗組和對照組小鼠在水迷宮中的反應時數據進行單因素方差分析，結果如表1。

3　討論

已有研究表明，睡眠對記憶的形成、儲存等都有密切關系[1-3]，而睡眠剝奪會對記憶造成一定損害。鑒于睡眠剝奪對記憶的影響已有大量的實驗證明，所以本實驗在設計時，未設置正常對照組，即肯定了睡眠剝奪對學習記憶的不良作用。該實驗中Morris水迷宮法進行小鼠學習記憶的測試顯示，睡眠剝奪后，高濃度L-蘋果酸灌胃組的小鼠在蘋果酸灌胃后學習記憶能力并沒有得到明顯的改善；中、低濃度L-蘋果酸灌胃組的小鼠在蘋果酸灌胃后學習記憶能力得到了明顯的改善；蘋果汁灌胃組的小鼠在蘋果汁灌胃后學習記憶能力得到了明顯的改善，且改善效果優于中、低濃度蘋果酸灌胃組。從總體的實驗結果來看，適當的蘋果酸濃度的確能夠起到改善學習記憶的作用，同時蘋果也的確有一定的改善學習記憶的作用。但是蘋果是否僅通過L-蘋果酸來改善學習記憶，即蘋果中是否還存在其他可以改善學習記憶的物質還需要進行進一步的研究。

睡眠剝奪可打亂人體的生物鐘，干擾腦內神經遞質的含量及分布，誘導某些異?；虻奶禺愋员磉_，使腦內的神經網絡結構偏離平衡，從而導致學習和記憶功能障礙。海馬—邊緣系統中有豐富的膽堿能纖維分布，與學習記憶關系密切。睡眠剝奪后的SD大鼠學習能力明顯下降，海馬乙酰膽堿含量明顯降低[9]。有研究表明L-蘋果酸對睡眠剝奪小鼠的學習記憶能力具有明顯的改善作用，可以通過改善腦組織的能量代謝，調整腦內神經遞質幫助學習記憶功能的恢復[10-11]。但L-蘋果酸通過影響海馬乙酰膽堿來達到改善學習記憶能力作用的具體機制還有待進一步證實和研究。

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學習記憶測定的結果[（±s），s]

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學習記憶測定的結果[（±s），s]

項目睡眠剝奪前睡眠剝奪后P值生理鹽水0 . 7 m g / m L L -蘋果酸組0 . 3 5 m g / m L L -蘋果酸組0 . 1 7 5 m g / m L L -蘋果酸組蘋果汁組5 6 . 9 5 ± 5 . 3 2 5 7 . 1 5 ± 8 . 9 9 0 . 9 7 5 4 9 . 3 8 ± 9 . 9 8 5 2 . 1 8 ± 7 . 1 7 0 . 7 1 4 4 8 . 8 5 ± 6 . 1 6 3 6 . 3 ± 1 6 . 4 2 0 . 2 8 4 5 1 . 7 7 ± 7 . 6 2 4 7 . 1 3 ± 2 3 . 1 7 0 . 7 5 8 5 0 . 1 8 ± 9 . 0 5 3 2 . 8 2 ± 3 . 6 1 0 . 0 3 7

實驗中高濃度的蘋果酸并沒有起到明顯的改善學習記憶的作用，可能是由于小鼠個體對蘋果酸敏感度的差異，蘋果酸無法作用于相應靶點來達到改善學習記憶的作用引起，也可能是由其他原因造成，該實驗并未對此進行深入的研究。實驗中，由于采用的樣本含量較小，存在著統計學誤差，建議對實驗進行進一步的完善，擴大樣本的含量，來為該實驗的實驗結果提供更可靠的數據支持。L-蘋果酸及蘋果對于睡眠剝奪后學習記憶功能的影響對于夜間作業人員的保健具有重要意義，提供了一條新的思路。

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[11]Morris R．Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat[J].Neurosci Methods，1984，11: 47.

Effect of L-malic Acids and Apples on the Sleep Deprivation of Memory of Mice

LU Chao-yin1,SHEN Yu-sha1,ZHANG Ye1,NI Ye-qin1,YIN Yuan-jun2
1.Second Clinical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China；2.College of Basic Medicine,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China

Objective To study the effect of different concentrations of l-malic acids and apples on the sleep deprivation of memory of mice.Methods 15 mice were randomly divided into the control group(ICR+normal saline group)and the experiment group(ICR+high,middle and low concentrations of l-malic acid group,ICR+apple group),and the spatial learning and memory of mice before and after the sleep deprivation was tested by the Morris water maze.Results The learning memory of ICR+high concentration of l-malic acid group was not obviously improved,and the learning memory of ICR+middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group was obviously improved,and the learning memory effect of ICR+apple juice group was better than that of middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group.Conclusion The appropriate concentration of l-malic acids and apple can have an effect of improving the learning memory,but whether the improvement mechanism of apples on learning memory is only related to the l-malic acid needs the further study.

Sleep deprivation;L-malic acid;Apple;Learning memory

R96

A

1672-5654（2016）11（b）-0016-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.016

2016-08-11）

盧超銀（1995.7-），女，浙江臨海人，本科在讀，研究方向：行為醫學。

印媛君（1971.11-），女，浙江浦江人，碩士研究生，副教授，研究方向：心肌缺血，郵箱：hzyyjun@126.com。