A101/B301基因家系分析

張韋，王守燕，徐祥

濱州市中心血站，山東濱州256602

A101/B301基因家系分析

張韋，王守燕，徐祥

濱州市中心血站，山東濱州256602

目的研究ABO血型表型與基因型不符的家系，分析產生該現象原因。方法采用試管法對微板法篩查出的正反定型不符血樣做進一步血型血清學分析進行亞型確認。對亞型樣本進行血清學分析和DNA測序，測序結果用軟件比對分析后確定其基因型。結果從9 278份AB型無償獻血者血樣中檢出AB亞型血樣6例（檢出率為6.5/萬），其中AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。1例AB3亞型個體，紅細胞與標準抗-B血清凝集為1+混合視野，若按血清表現型可歸為ABend；但是經基因測序其基因均為A101/B301，且父代和子代也均為典型B3亞型。結論ABO亞型確認應采用血型血清學、分子生物學和遺傳學相結合的檢測方法；B亞型基因與正常的A基因結合在一起表現為α-1,3D-半乳糖轉移酶活性的降低，使B抗原表達量減弱。

ABO亞型；基因型；家系

ABO亞型是ABO血型抗原較弱的亞型或變異型，它具有明確的血清學特點,并且具備遺傳基礎。ABO亞型產生的主要原因是基因第6外顯子或第7外顯子發生了點突變，降低或改變了糖基轉移酶的活性，導致抗原變異或弱表達，致使血型血清學表現為紅細胞上抗原減弱、混合視野、血清中出現不規則抗體或抗體活性減弱，從而給血型鑒定工作和臨床輸血帶來了困擾[1-4]。血型血清學反應相同的抗原，可以有不同血型基因表達，如血清學表型同為A3型或Ax型的ABO血型亞型，其ABO基因可能不同，稱之基因異質性[5]。盡管ABO亞型出現的頻率不高，檢測過程復雜，但是臨床意義很大，值得我們去深究。筆者在獻血者血型鑒定中發現1例血型血清學ABend亞型，而基因分型為AB3的獻血者，血型血清學表型與血型基因型不一致，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

9 278份AB血型樣本均來源于山東省濱州市2014—2015年無償獻血者,經獻血者知情同意后，EDTA抗凝管采集靜脈血5mL用于檢測,去除重復樣本，獻血者身體健康檢查按照2011年由中華人民共和國衛生部和中國國家標準化管理委員會聯合發布的《獻血者健康檢查要求》GB18467-2011操作。

1.2試劑與儀器

單克隆抗-A、抗B試劑（批號20121018）；抗-H試劑（批號20130408）；ABO反定型用紅細胞（批號20135 337）；血液基因組DNA抽提試劑盒（批號：M1218）Premix Tap（批號：A1301A）BigDye terminator V3.1Sequencing(批號：9700型PCR擴增儀和3730型DNA測序儀；TL-16R平板離心機。

1.3血型血清學檢測

按照2006年中華人民共和國衛生部醫政司頒布的《全國臨床檢驗操作規程》第3版:246-269操作[6]。

1.4ABO基因第6、7外顯子直接測序和單體型序列分析

具體操作步驟參照文獻[7-8]。測序引物參照Olsson等設計的2對引物，分別對Exon6和Exon7進行擴增，測序引物見表1。

表1　第6、7外顯子直接測序引物

2　結果

2.1血型血清學結果

從2014—2015年濱州市9 278份AB型無償獻血者血樣中，檢出AB亞型血樣6例，AB亞型在AB型人群中的檢出率為6.5/萬，6例AB亞型標本分別為AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。AB3亞型獻血者中的1位先癥者，男，40歲，2014年1月獻血200mL，復檢血型時發現正定型AB型，反定型A型。紅細胞與標準抗-B血清凝集為1+混合視野，經血清學初步檢測懷疑為ABend型。經獻血者和其家庭成員知情同意后，用EDTA抗凝管采集其妻子、兒子、父親、姐姐、外甥女采集靜脈血5mL用于檢測。血型血清學檢測中，先癥者和其姐姐紅細胞與標準抗-B血清凝集均為1+混合視野，血漿中含抗-B抗體，血清學表型為ABend型，先癥者父親、兒子和外甥女均為典型B3亞型。這個家庭的血型遺傳不符合孟德爾遺傳規律，需做進一步分析和檢測。家系成員血型血清學結果見表2。

2.2ABO基因直接測序分析

先癥者父親、兒子和外甥女第6和第7外顯子直接測序結果顯示：261位delG、297位A/G、526位C/G、657位C/T、703位G/A、796位C/A、803G位/C、930位G/A、1054位C/T、1096 G/A雜合，其基因型為B301/ O01；先癥者和姐姐第6和第7外顯子直接測序結果與B101標準序列相比，出現297A/G、476C/T、526C/G、657C/ T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1054位C/T、1096G/A雜合，有關序列信息，根據標本多態性位點情況，指定其基因型為B301/A102。B301基因與B101序列比較，在1054位出現C>T單堿基突變。

2.3ABO基因克隆測序分析

先癥者樣本克隆測序結果顯示，1條單倍體為B301突變發生在1054位C>T,導致氨基酸第352位氨基酸由精氨酸（Arg）轉變為色氨酸（Trp；）另一條單倍體為A102。基因測序結果見圖1，家系遺傳特征見圖2。

圖1　先證者基因測序結果

圖2　家系圖譜

3　討論

混合視野凝集是B3亞型紅細胞的明顯特征，顯微鏡下觀察，B3細胞與抗-B或抗AB血清孵育后出現一些被絕大部分游離的非凝集紅細胞包圍的數個紅細胞形成的凝集塊。若將凝集細胞去除，剩余的游離細胞再與抗-B血清反應，仍然出現混合視野凝集[9-12]。先癥者和姐姐紅細胞與抗-B凝集達不到3+混合視野，且還有較弱的抗-B抗體,若按血清表現型可歸為ABend，基因型為A101/B301，經家系調查其父代和子代均為含有B301基因單體的B3亞型，故可確定其血型為AB3亞型。據報道，亞型人A1B3血漿中大多含有抗-B抗體[13-15]，致使正反定型不一致現象。日常的檢測中一般都使用單克隆抗體血清檢測，因單克隆抗體效價都很高，增加了與細胞的反應強度，如本家系中的3例B3亞型標本，先證者父親、兒子、外甥女與單克隆血清反應均≥4+，與人源血清反應明顯減弱。

表2　血型血清學反應格局

本家系測序結果表明，先證者與其姐姐的1054C>T突變來自他們的父親，他們的孩子又遺傳了該突變，符合孟德爾遺傳規律。這一突變與B101序列比較，在1054位出現C>T,引起多肽鏈第352位精氨酸Arg被色氨酸Trp取代。色氨酸為非極性a氨基酸,而堿性的精氨酸是含有胍基的極性a氨基酸，生理條件下帶正電荷。氨基酸替換打破了電荷平衡，造成了a-1,3-D-半乳糖基轉移酶活性部分喪失，使B抗原合成量減少。

ABO亞型的確認不能單單從血清學或分子生物學改變上來判定，血型血清學表現一致的ABO亞型個體，其ABO亞型基因結構可能不同，ABO亞型基因相同的ABO亞型個體，血型血清學表現可能會不一致。本家系檢出的2例AB3亞型個體，如果單單只做血型血清學試驗，應當歸為ABend亞型；但是他們的基因都是A101/B303，而且父代和子代均為典型B3亞型。臺灣人Li L等曾報道父代Ax血型，子代與B基因結合在一起AxB加強為A3B[16]。由此筆者推斷，個體基因的兩條單倍體在轉錄過程中相互影響，A亞型基因與正常的B基因結合在一起表現為α-1,3-N-氨基半乳糖轉移酶活性的增強，A抗原表達量增加；B亞型基因與正常的A基因結合在一起表現為α-1,3-D-半乳糖轉移酶活性的降低，B抗原表達量減弱。

該研究標本量較少致使調查結果有些局限，如果能發展簡單易操作的基因分型技術，使大多數血型工作者都能掌握該技術，可以搜集大量表型正常的標本一起做研究，就能更加確切的分析該地區ABO基因的遺傳多態性，更精準地為臨床患者進行血液配型工作，增加臨床輸血的安全性和有效性。

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Analysis of A101/B301 Gene Family

ZHANGWei,WANG Shou-yan,XU Xiang
The Blood Center of Binzhou City,Binzhou,Shandong Province,256602 China

Objective To research the gene family of ABO phenotype failing to match the genetype and analyze its cause. Methods The positive typing and reverse typing?unconformity blood samples screened out by microplate test were given the further blood group serology analysis for subgroup confirmation by the test tube method,and the subgroup samples were given the serological analysis and DNA sequencing,and the genetype was confirmed after analysis.Results 6 cases of AB subtype blood samples were tested from 9 278 cases of unpaid blood donors whose blood type was AB,and the detection rate was 65 per thousand,including 1 case whose blood type was AelB,4 cases whose blood type were AB3,and 1 case with B (A)phenotype,and 1 case with AB3 subtype,but all genes were A101/B301 after the gene sequencing,and the sire?generation and filial generation were the typical B3 subtype.Conclusion ABO subtype confirmation should adopt the blood group serology,molecular biology and genetics,and the manifestation of subtype B gene and normal A gene is α-1,and the decrease of 3D-galactose transferase activity weakens the B antigen expression level.

ABO subtype;Genetype;Gene family

R457.1

A

1672-5654（2016）11（b）-0063-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.063

2016-08-15）

張韋（1976-），女，山東濱州人，在職碩士在讀，主管技師，主要從事輸血質量控制和輸血研究工作。