瓊玉膏抗皮膚自然老化作用的實驗研究

錢昕妤， 魏躍鋼

(1.江蘇省無錫市惠山區人民醫院皮膚科， 江蘇 無錫 214000 2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院中醫皮膚教研室， 江蘇 南京 210023)

瓊玉膏抗皮膚自然老化作用的實驗研究

錢昕妤1， 魏躍鋼2

(1.江蘇省無錫市惠山區人民醫院皮膚科， 江蘇 無錫 214000 2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院中醫皮膚教研室， 江蘇 南京 210023)

目的:探討瓊玉膏抗皮膚自然老化的作用機理。方法:50只18個月齡大鼠隨機分為空白對照組、瓊玉膏大劑量組(14g/kg)、瓊玉膏中劑量組(7g/kg)、瓊玉膏小劑量組(3.5g/kg)和維生素E組(2g/kg)，各組大鼠均連續灌胃給藥4周，測定皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸、丙二醛含量和透明質酸水平，比較皮膚厚度和皮膚血管化程度；測定皮膚組織中VEGF和BFGF蛋白的表達。結果:瓊玉膏可增加大鼠皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸和透明質酸含量，降低丙二醛含量，并且呈劑量依賴性；瓊玉膏可劑量依賴性增加大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目；瓊玉膏可劑量依賴性增加大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量。結論:瓊玉膏可增加皮膚組織SOD活性及丙二醛含量而提高皮膚組織的抗氧化防御能力，增加VEGF和BFGF蛋白表達而提高皮膚血管化程度，增加膠原蛋白和透明質酸的含量而提高皮膚厚度而具有較好的抗皮膚老化作用。

皮 膚； 自然老化； 瓊玉膏

本課題研究瓊玉膏抗皮膚自然老化作用，現報告如下。

1　資料與方法

1.1實驗動物:選用18月齡SPF級SD雄性大鼠50只，體重300～500g，SPF級層流柜內分籠飼養，實驗正式開始前適應性喂養1周，整個實驗中大鼠自由攝食飲水和進食標準顆粒飼料。

1.2實驗藥品:瓊玉膏由本實驗自制:取地黃500g、茯苓100g，水提2h×3次，合并濾液；將人參50g切片，適量水浸泡24h，文火水提2h×2次，合并濾液；混合兩種濾液，靜置，取上清液，水浴濃縮至1000mL(比重1.2l～1.25 kg/L)，加入煉蜜350mL，繼續濃縮至1000mL，收膏過濾(比重1.40kg/L)。維生素E軟膠囊(0.1g/粒)，上海信誼藥業延安藥業提供，注冊證號為國藥準字H31020237。

1.3主要試劑:超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測試劑盒、透明質酸(Hyaluronic Acid，HA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗鼠八因子相關抗原(Ⅷ－Rag)多克隆抗體(北京中山生物技術有限公司)，SP免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑(福州邁新生物技術公司)，蛋白抽提試劑(美國Thermo公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，血管內皮生長因子抗體(Vascular endothelial Growth Factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，BFGF)抗體、兔抗鼠GAPDH單抗、辣根過氧化物酶標記二抗(美國CST公司)，ECL Prime蛋白印跡試劑(美國Thermo公司)。

1.4主要儀器:BX52型光學顯微鏡(日本Olympus公司)，核酸蛋白分析儀(美國BECKMAN公司)，電泳儀、制膠板、轉膜儀(美國Bio－Red公司)，電泳槽(美國Bio－Red公司)，凝膠成像系統(以色列Minilumi公司)

1.5分組與造模:將大鼠按隨機數字表法隨機分為5組，分別為空白對照組、瓊玉膏大劑量組(14g/kg)、瓊玉膏中劑量組(7g/kg)、瓊玉膏小劑量組(3.5g/kg)和維生素E組(2g/kg)。瓊玉膏大劑量、中劑量和小劑量組大鼠分別給予瓊玉膏原液以及用純凈水按1:1或1:3稀釋后進行灌胃，維生素E組大鼠灌胃給予維生素E2g/kg，空白對照組大鼠灌胃給予等體積純凈水。各組大鼠均連續灌胃給藥4周。

1.6觀察指標:各組大鼠給藥4周后分別測定皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸、丙二醛含量和透明質酸水平，比較各組大鼠皮膚厚度和皮膚血管化程度；并且測定各組大鼠皮膚組織中VEGF和BFGF蛋白的表達。

1.6.1皮膚組織SOD活性、MDA、HYP及HA含量的測定:各組大鼠處死后立即脫毛后取頸背部皮膚組織約2cm×3cm，制備10%皮膚組織勻漿，離心，取上清液進行測定。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，HYP及MDA含量測定分別采用二甲氨基苯甲醛法及硫代巴比妥酸法，HA含量測定采用酶聯免疫吸附法(Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)測定。

1.6.2皮膚厚度的測定:皮膚樣本均被切成0.5cm×0. 5cm大小的組織塊進行HE染色，具體步驟如下:多聚甲醛浸泡，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，貼于載玻片，烘干。二甲苯脫去石蠟，乙醇水化，最后入蒸餾水。蘇木精染色，經酸水及氨水中分色，蒸餾水沖洗，乙醇脫水，入乙醇伊紅染色液染色，脫水，透明，封固。光鏡下觀察皮膚病理學形態觀察。使用Image－Pro Plus顯微分析系統，形態計量表皮厚度(μm)。

1.6.3皮膚血管化程度的測定:石蠟標本連續切片后進行SP免疫組化染色，具體步驟如下:常規脫蠟、水化，胃蛋白酶抗原修復，PBS沖洗。滴加兔抗人八因子相關抗原(Ⅷ－Rag)多克隆抗體(1:100)，37℃孵育60min，4℃下過夜，室溫下孵育20min；PBS沖洗。滴加二抗，37℃孵育30min；PBS沖洗；3，3－二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗；梯度乙醇脫水干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察老化皮膚組織血管化程度(放大倍數200×)。

1.6.4皮膚組織VEGF和bFGF含量測定:稱取組織重量，提取蛋白并進行蛋白定量，調整蛋白濃度為4. 0mg/mL，煮沸5min變性。按蛋白量40μg/孔進行10%SDS－PAGE凝膠電泳(80V20min，150V約1.5h)，轉膜(400mA2h)至0.45μm的PVDF膜，于5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入一抗，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜，滴加二抗，室溫孵育，洗膜，顯色，顯影，對條帶進行定量分析。

1.7統計學方法:采用SPSS 19.0進行數據統計，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，多重比較采用LSD法多重比較采用什么方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量與空白對照組差異均無統計學意義(P＞0.05)；瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP和HA含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，MDA含量較瓊玉膏小劑量組大鼠顯著降低(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP和HA含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，MDA含量較瓊玉膏中劑量組大鼠降低，差異具有統計學意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚組織SOD活性、MDA和HA含量較空白對照組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，MDA含量較空白對照組大鼠降低，差異具有統計學意義(P＜0.01)，具體見表1。

表1　各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較(±s)

表1　各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較(±s)

與空白對照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別nSOD(U/mg)HYP(μg/mg)MDA(nmoL/mg)HA(μg/mg)空白對照組1022.12±2.620.21±0.043.96±0.52251.64±13.62瓊玉膏小劑量組1024.65±2.750.23±0.053.85±0.47263.27±15.74瓊玉膏中劑量組1027.34±2.84?，＃0.29±0.06?，＃2.95±0.42?，＃293.26±14.66?，＃瓊玉膏大劑量組1035.21±3.35?，＃，＆0.40±0.07?，＃，＆2.28±0.36?，＃，＆324.71±15.49?，＃，＆維生素E組1037.49±3.47?0.38±0.06?2.57±0.33?316.35±13.29?

圖1　皮膚組織HE染色結果 A:空白對照組；B:瓊玉膏小劑量組；C:瓊玉膏中劑量組；D:瓊玉膏大劑量組；E:維生素E組

圖2　皮膚組織免疫組化分析結果 A:空白對照組；B:瓊玉膏小劑量組；C:瓊玉膏中劑量組；D:瓊玉膏大劑量組；E:維生素E組

2.2各組大鼠皮膚真皮層厚度和血管化程度的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目與空白對照組差異均無統計學意義(P＞0.05)，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較空白對照組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，具體見表2。

2.3各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量與空白對照組差異均無統計學意義(P＞0. 05)，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較空白對照組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，具體見表3。

表2　各組大鼠皮膚真皮層厚度和皮膚血管數目的比較(±s)

表2　各組大鼠皮膚真皮層厚度和皮膚血管數目的比較(±s)

與空白對照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別n真皮層厚度(μm)血管數目(個/高倍視野)空白對照組10424.12±25.363.65±1.54瓊玉膏小劑量組10436.45±23.744.74±1.60瓊玉膏中劑量組10477.27±25.29?＃7.82±2.47?＃瓊玉膏大劑量組10524.65±29.66?＃＆12.35±2.54?＃＆維生素E組10494.38±28.42?11.57±2.76?

表3　各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的比較(±s)

表3　各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的比較(±s)

與空白對照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別nVEGFBFGF空白對照組100.24±0.040.32±0.05瓊玉膏小劑量組100.26±0.050.35±0.04瓊玉膏中劑量組100.38±0.06?＃0.44±0.06?＃瓊玉膏大劑量組100.48±0.05?＃＆0.54±0.07?＃＆維生素E組100.42±0.06?0.48±0.05?

3　討 論

活性氧自由基造成基因損傷是細胞老化的一項重要機制。自由基是一類能獨立存在的具有活潑不成對電子的特殊物質，是人體生命活動中多種生化反應的中間代謝產物，介導了許多疾病和老化的發生，與組織過氧化、DNA損傷、蛋白質交聯變性、細胞信號轉導都有重要聯系。超氧陰離子自由基(O2·－)是生物活性最離的活性氧自由基之一，可對生物膜、蛋白質和核酸造成損傷，誘發細胞老化。SOD是機體主要抗氧化酶之一，參與清除活性氧自由基[1]。MDA是自由基脂質過氧化的分解產物，其水平的變化間接反映了組織中自由基的變化。本研究結果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織SOD活性較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，丙二醛含量較瓊玉膏小劑量組大鼠降低，差異具有統計學意義(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織SOD活性較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，丙二醛含量較瓊玉膏中劑量組大鼠降低，差異具有統計學意義(P＜0. 01)，說明瓊玉膏可以劑量依賴性提高老化皮膚組織的抗氧化防御能力。

真皮組織結構的改變是皮膚老化的主要原因，皮膚老化時出現的皺紋、彈性下降等均與真皮中膠原蛋白和膠原纖維的含量下降有關。本研究結果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數目較空白對照組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，說明瓊玉膏可劑量依賴性增加老化皮膚真皮層厚度及血管數目。

膠原蛋白是哺乳動物皮膚的組成成分，其肽鏈氨基酸中占主要成分的是羥脯氨酸[2]，因此羥脯氨酸的含量可以反映皮膚中膠原蛋白的含量。粘多糖足構成細胞間結締組織的主要成分，其中透明質酸是一種直鏈酸性粘多糖，可結成凝膠將細胞緊密地粘合在一起，能保持組織間的水分，并使皮膚具有一定的堅韌性、彈性和返回性。本研究結果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織羥脯氨酸和透明質酸含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織羥脯氨酸和透明質酸含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，說明瓊玉膏可以劑量提高老化皮膚組織膠原蛋白和透明質酸的表達。

VEGF是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，具有維持血管正常形態和完整性、提高血管通透性、促進內皮細胞遷移和增殖等作用，還可誘導多種組織蛋白酶，降解細胞外基質以利于血管生成。BFGF是成纖維細胞生長因子家族原型，可刺激成纖維細胞增殖和遷移、誘導或促進膠原的形成，增加膠原酶及纖維蛋白酶原激活劑的產生釋放等作用[3]。本研究結果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，并且瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，說明瓊玉膏可以劑量依賴性增加大鼠老化皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的表達。

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1006－6233(2016)11－1888－04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.058

江蘇省中醫藥局科技項目，(編號:LZ11180)

魏躍鋼