大型海藻厭氧發酵特性研究

張 毅，孔曉英，孫永明，王忠銘，李連華，楊立貴，任守軍，袁振宏

(1.中國科學院廣州能源研究所 中國科學院可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.中國科學院大學，北京 100049；3.蘭州理工大學 西部能源與環境研究中心,甘肅 蘭州 730050)

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大型海藻厭氧發酵特性研究

張 毅1,2，孔曉英1，孫永明1，王忠銘1，李連華1，楊立貴1,2，任守軍3，袁振宏1

(1.中國科學院廣州能源研究所 中國科學院可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.中國科學院大學，北京 100049；3.蘭州理工大學 西部能源與環境研究中心,甘肅 蘭州 730050)

文章采用中溫批式厭氧發酵工藝，研究清洗及未清洗海帶在不同接種率下，鹽度對厭氧發酵特性的影響。研究結果表明：相同底物濃度發酵時，未清洗海帶的產氣性能要優于清洗海帶，無機鹽對產氣率提高約13%～25%。未清洗海帶組在鹽度為12.96 g·L-1時的產氣性能最佳，產氣率和產甲烷率分別為464.4±0.39和288.28±0.24 mL CH4·g-1VSadded，比相同條件下清洗海帶的產甲烷率提高29.56%，此時發酵液中主要金屬離子濃度K+4780 mg·L-1，Mg2+250 mg·L-1，Ca2+130 mg·L-1和Na+1600 mg·L-1，表明適宜濃度的無機鹽有利于厭氧發酵的產氣性能。

海帶；接種率；鹽度; 厭氧發酵；甲烷

生物質能因清潔低碳、可再生和原料豐富等特點受到越來越多國家的關注，但以高粱玉米等糧食作物為代表的第一代能源作物和以纖維素類為原料的第二代能源作物因其占用大量耕地肥料等限制了其發展前景，而藻類作為第三代的生物質能，具有不與“糧”爭地、生長迅速、單位面積產量高和資源量豐富等優點[1]，正成為未來生物能源的研究焦點。

大型海藻生物量大、碳水化合物含量高和木質素含量較低[2]，適合作為厭氧發酵制備生物燃氣的原料。美國較早開展了海藻產甲烷的研究，并在70年代建立了海藻制備甲烷的技術工藝[3]。此外，德國、荷蘭和日本[4]等發達國家也對滸菜(Enteromorphaprolifera)，江蘺(Gracilariaspp)、掌狀紅皮藻(Palmariapalmata)和海帶(Laminariajaponica)等大型海藻發酵產甲烷進行了研究。目前，對大型海藻厭氧發酵預處理的研究比較熱門，如Oliveira[5]等對江蘺(Gracilarialemaneiformis))采用清洗、浸泡和熱堿處理等預處理結合的方法，發現采用清水洗凈和浸泡的預處理方式能顯著提高產甲烷率，達到481 mL·g-1VS，熱堿處理雖能增加海藻的溶解，但對產甲烷率并無影響；Tedesco[6]等對昆布進行機械破碎成漿與污泥進行共發酵，發現預處理后的樣品的產甲烷率提高了20%。另外在干燥[7]、超聲[8]、紫外[9]和酸處理[10]方面也有涉及，這些預處理前的共同點是先將海藻清洗干凈，并未考慮無機鹽對發酵微生物的影響。未清洗的海藻表面會夾帶大量的無機鹽，其中鈉鉀等輕金屬離子對發酵過程有一定的影響作用，適量的無機鹽能刺激微生物的生長，而過量鹽分對微生物的生長有毒害作用，抑制發酵產氣[11]。

因此，為了定量研究鹽度對厭氧發酵制備生物燃氣過程中影響，筆者將利用清洗與未清洗的海帶為原料，在不同VS接種率下進行厭氧發酵，分析不同發酵條件下發酵過程中鹽度,pH值等參數的變化，研究不同無機鹽度下海帶的厭氧發酵特性，從而為適宜條件下大型海藻制備生物能源提供理論依據。

1 實 驗

1.1 原料特性

試驗原料為海帶，購自廣州市天河區長湴菜市場。海帶的總固體含量(TS)、揮發性固體含量(VS)和灰分含量分別為61.24%，51.44%和38.15%，C，H，N和S元素質量分數分別為37.36%，5.67%，2.51%和1.20%，熱值為14.56 kJ·g-1。漂洗工藝為用自來水漂洗3次，浸泡24 h，自然烘干后切割成2 cm左右，然后在粉碎機中粉碎成粉末狀，裝包置于-20℃冰箱中保存。清洗后海帶的總固體含量(TS)、揮發性固體含量(VS)和灰分含量分別為85.68%，71.53%和16.51%。

1.2 接種污泥來源和特性

厭氧消化污泥來源于博羅一座養豬場沼氣池。接種前采用1 mm篩網過濾除去接種物中大顆粒雜質。接種污泥的pH值為7.72，鹽度為4.42 g·L-1，TS含量為1.15%，VS/TS為54.39%。

1.3 實驗裝置及操作

裝置為2500 mL玻璃反應器，有效容積為2000 mL，反應裝置如圖1所示。反應器置于35℃±1℃的恒溫水浴鍋中。清洗組和未清洗組中的菌種與海帶的VS比分別為2∶1，1∶1和1∶2，其發酵液的總揮發性固體濃度為1.73%，2.30%和3.45%，實驗組按初始發酵液鹽度編號，清洗組為4.65，4.72和5.11 g·L-1，未清洗組分別為6.46，7.99和12.96 g·L-1。每組實驗設置2個平行，空白對照組僅加入菌種。加料后反應器頂部充入高純N2以排除空氣。試驗期間每天早晚各手動震蕩1次，整個厭氧消化過程直至無氣體產出為止，共運行40 d。

1.液樣口；2.氣樣口；3.水浴鍋；4.通氣管；5.集氣瓶；6.排液管；7.集液瓶圖1 發酵裝置示意圖

1.4 測試及分析方法

TS和VS分別采用105℃干燥法和550℃干法灰化法[12]測定；C，H，N和S元素含量采用Vario EL cube 元素分析儀(德國Elementar公司)測定；金屬元素Na+，Mg2+，Ca2+、和K+采用Thermo Jarrell Ash公司的IRIS 1000 ER/S全譜直讀型等離子體耦合光譜發射儀分析。熱值(calorific value,CV)由量熱儀C2000(德國IKA@公司)測定；日產氣量采用排飽和食鹽水法計量，并將產氣量換算成標準狀態；pH值測定采用雷磁pHS-3C型pH計(上海精科科學儀器有限公司雷磁儀器廠)；鹽度采用便攜式鹽度測試儀(CLEAN CON200G1型)測定；揮發性脂肪酸(VFAs)的測定采用高效液相色譜儀waters e2695(美國waters公司)，柱子為Shodex KC-811，柱溫為50 ℃；流動相為0.1% H3PO4，流速為0.7 mL·min-1。分析前液體樣品首先在0℃～4℃，12000 r·min-1離心15 min，離心后的樣品再通過0.2 nm纖維素乙酸酯膜分離。生物燃氣中CH4和CO2等氣體含量采用島津GC2014型高效氣相色譜測定，TCD檢測器，Porapak Q 色譜柱，載氣為Ar，柱箱和檢測器溫度分別為50℃和120℃，測樣時間5 min。

2 結果與分析

2.1 厭氧發酵過程中的鹽度變化

厭氧發酵過程中鹽度的變化如圖2，在開始發酵時，未清洗組的初始鹽度為6.46～12.96 g·L-1，顯著高于清洗組的初始鹽度4.65～5.11 g·L-1，并且清洗組的初始鹽度差異較小，而未清洗組的初始鹽度差異較大，主要原因是清洗組的原料經漂洗浸泡后，海帶表面的無機鹽基本被去除干凈，而未清洗組的原料表面會附著大量的無機鹽，發酵原料濃度越高，夾帶的無機鹽會越多，鹽度差異也就越大。在發酵過程中，各實驗組中鹽度的變化趨勢基本一樣，主要分為3個階段：第1階段在發酵開始時，鹽度會小幅降低約為0.3 g·L-1，這主要是因為發酵液中的Na+，Mg2+，Ca2+，Fe3+和K+等一些離子，是微生物生長繁殖所必須的營養源，如Na+對維持微生物細胞內的滲透壓有著非常重要的作用，Ca和Mg是合成生物大分子重要組成部分及Mg2+作為生物酶的激活劑[13]。第2階段在發酵第3～8 d，鹽度增加較快，清洗組鹽度增加0.29～1.45 g·L-1，未清洗組鹽度增加1.29～2.16 g·L-1，主要是海帶細胞被發酵型細菌分解的水解酶所破壞，使得海帶細胞液中的無機鹽大量釋放，導致發酵液鹽度增長較快。此外，清洗組鹽度相比未清洗組增加較小，清洗組原料經浸泡24 h后，海藻細胞中部分離子滲透到水中，從而使得細胞液中的離子濃度較低。第3階段鹽度增加較小，約為0.5 g·L-1，主要原因是發酵液中的有機物逐漸被降解并釋放出少量的無機鹽離子。

通過鹽度為5.1和12.96 g·L-1兩組發酵前后主要離子濃度變化測定見表1，Mg2+和Ca2+濃度均降低，其中較為明顯的是UW3中Mg2+和Ca2+濃度降幅達到50%左右，這可能與發酵液中較多的微生物數量會需要大量的Mg2+和Ca2+有關[13]。海帶中金屬離子含量較多的是Na+和K+，其含量分別可達到28 mg·g-1和61 mg·g-1[14]，反應過程中原料中Na+和K+被釋放，因而發酵液中Na+和K+濃度會有較大范圍的增加：Na+為190～410 mg·L-1，K+為250～700 mg·L-1。

圖2 發酵液中的鹽度變化

表1 鹽度為5.1和12.96 g·L-1的主要離子濃度變化

2.2 厭氧發酵過程中的pH值變化

清洗和未清洗海帶厭氧發酵過程中pH值隨時間的變化如圖3和圖4。發酵開始前，清洗組的pH值差異較小，約為7.85，而未清洗組中隨著海帶鹽度濃度越高，pH值越低，約為7.64～7.98，主要原因是海藻夾帶的無機鹽中含有的Mg2+和Ca2+等弱酸性金屬離子能產生H+，從而使得發酵液的pH值降低。發酵開始后，所有實驗組的pH值變化趨勢基本一致，主要呈現“下降—上升—穩定”的趨勢，并且未清洗組的pH值波動要大于清洗組。首先發酵初期在發酵性細菌和產酸菌的聯合作用，海藻中容易降解的成分快速水解并產生大量的揮發性脂肪酸(VFAs)，VFAs大量生成使得發酵液pH值快速降低，在第5 d時均降至最低，清洗組pH值處于6.75～7.35之間，而未清洗組pH值處于6.3～7.15之間。同VS濃度的未清洗組均比清洗組的pH值低0.4，如清洗海帶鹽度5.11 g·L-1中發酵液pH值為6.75，未清洗鹽度12.96 g·L-1中發酵液pH值為6.35。當發酵進行到6～14 d，發酵液中的pH值整體呈上升趨勢，此時產甲烷菌大量繁殖和活性不斷增強，VFAs不斷被降解，同時系統產生了大量的氨氮[15]，使得發酵液pH值不斷升高，并在20 d達到穩定并維持在7.18～7.57。

圖3 清洗組pH值隨時間的變化

圖4 未清洗組pH值隨時間的變化

2.3 厭氧發酵過程中的揮發性脂肪酸(VFAs)變化

發酵液中第6 d和第11 d的揮發性脂肪酸成分見表2。發酵初期，原料迅速降解并產生大量揮發性脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等，此外還有少量的甲酸和異丁酸等，此時有機酸的產生速率遠大于分解速率，導致有機酸的大量積累。發酵在第4～6 d時，發酵液中pH值最低，對應的揮發性脂肪酸含量達到最高，海帶VS濃度越高，其發酵液中有機酸的含量越多，而同VS濃度的海帶，未清洗比清洗海帶產生揮發性脂肪酸的種類和含量均要多。在鹽度為5.11 g·L-1和12.96 g·L-1時，清洗和未清洗海帶在第6 d的揮發性脂肪酸酸含量分別為1824.4 mg·L-1和5042 mg·L-1，并且未清洗海帶發酵液中檢測到了乙酸、丙酸和戊酸，而清洗海帶發酵液中主要為乙酸和丙酸，未清洗海帶中無機鹽有效促進了揮發性脂肪酸的產生。隨后發酵過程中，有機酸逐漸被消耗，乙酸優先被產甲烷菌利用，當乙酸消耗到一定程度時，才開始利用其它代謝底物，而丙酸和丁酸必須轉化成乙酸才能微生物利用，從表2可知，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸是厭氧發酵制備生物燃氣過程的重要中間代謝產物，并且揮發酸轉化為乙酸優先順序為：丁酸>戊酸>丙酸。

表2 發酵過程中第6天和第11天的揮發性脂肪酸產量

注：ND為未測出。

2.4 厭氧發酵過程中的日產氣量變化

清洗和未清洗海帶厭氧發酵日產氣量隨反應時間變化如圖5和圖6，可見不同濃度海帶發酵產氣的總體趨勢大致分為3個階段。發酵初期為水解階段，發酵型細菌將原料中易被利用的有機物分解為小分子物質，各組日產氣量約為800 mL，根據氣相色譜測定氣體中成分主要為CO2，CH4含量低于10%。發酵到第3天時基本進入產酸階段，清洗海帶組的產酸階段持續2天，日產氣量為550～1200 mL，未清洗海帶的產酸時間隨鹽度的增加而延長，這與揮發性酸的變化規律也一致，鹽度為12.96 g·L-1的產酸時間較長為4天，日產氣量約為600 mL。隨后發酵系統集中產甲烷，根據氣相色譜測定沼氣中CH4體積分數均大于50%，表明發酵系統已進入穩定的產甲烷階段。實驗組在發酵第5～8 d達到產氣高峰，清洗組的最大日產氣量分別為780 mL，1450 mL和2720 mL，未清洗組的最大日產氣量分別為860 mL，1580 mL和2180 mL。在經過產氣高峰后，隨著揮發性有機酸不斷被消耗，發酵液中可利用的有機物越來越少，各反應器產氣量也逐漸減少直至停止。

圖5 清洗組的發酵日產氣量

圖6 未清洗組的發酵日產氣量

2.5 厭氧發酵過程中的累積產氣率變化

清洗和未清洗海帶累積產氣率隨發酵時間的變化如圖7和圖8。清洗組的產氣速率較快，發酵進行到第13d時，系統產氣量占到總產氣量的90%以上；未清洗組的產氣速率隨著發酵液中鹽度的增加而變慢，發酵系統產氣量占到總產氣量90%所需的時間分別為5，12和22 d。從表3可知，清洗海帶在鹽度4.72 g·L-1產氣性能最佳，產氣率、產甲烷率和甲烷含量分別為423.05±32.88 mL·g-1VS，267.46±20.8 mL CH4·g-1VS和63.25%；未清洗海帶在鹽度7.99 g·L-1的產氣率最高，達到527.57±2.18 mL·g-1VS，而產甲烷率和甲烷含量則隨著鹽度的升高逐漸增加，在鹽度為12.96 g·L-1的產甲烷率和甲烷含量最高，為288.28±0.24 mL CH4·g-1VS和62.09%，比同VS濃度清洗海帶的產甲烷率提高29.56%。發酵液中無機鹽尤其是金屬離子，在一定的濃度范圍內對發酵系統起著不同作用，如Na+，Mg2+和Ca2+的質量濃度在100～200 mg·L-1，75～150 mg·L-1和100～200 mg·L-1能刺激發酵過程；當濃度增加到Na+為3500～5500 mg·L-1，Mg2+為1000～1500 mg·L-1，Ca2+為2500～4500 mg·L-1時，對發酵過程產生中等強度的抑制；當濃度更大時，Na+為8000 mg·L-1，Mg2+為3000 mg·L-1，Ca2+為8000 mg·L-1時，對發酵過程產生重度抑制作用[16]。W3和UW3發酵液中Mg2+，Ca2+和Na+濃度均未達到抑制濃度，但UW3在Mg2+250 mg·L-1，Ca2+130 mg·L-1和Na+1600 mg·L-1產甲烷率更高，表明發酵液中適量無機鹽有利于海帶厭氧發酵的產氣性能。

表3 厭氧發酵的產氣率、產甲烷率和甲烷含量

圖7 清洗組累積產氣量隨發酵時間的變化

圖8 未清洗組累積產氣量隨發酵時間的變化

3 結論

清洗海帶組中鹽度為4.72 g·L-1的產氣性能最佳，累積產氣率、產甲烷率和甲烷含量為423.05±32.88 mL·g-1VS，267.46±20.8 mL CH4·g-1VS和63.25%。在鹽度為12.96 g·L-1，主要離子濃度Mg2+250 mg·L-1，Ca2+130 mg·L-1和Na+1600 mg·L-1時，海帶厭氧發酵的產氣性能最佳，累積產氣率、產甲烷率和CH4含量分別為464.4±0.39 mL·g-1VS，288.28±0.24 mL CH4·g-1VS和62.09%，比同VS濃度清洗海帶的產甲烷率提高29.56%，適量無機鹽能促進發酵系統揮發性有機酸的生成，有利于海帶厭氧發酵的產氣性能。

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Characteristics of Anaerobic Digestion of Marine Macro-algae/

ZHANG Yi1,2,KONG Xiao-ying1,2,SUN Yong-ming1,WANG Zhong-ming1,LI Lian-hua1,YANG Li-gui1,2,REN Shou-jun3,YUAN Zhen-hong1/

(1.Guangzhou Institute of Energy Conversion Chinese Academy of Sciences,CAS,Key Laboratory of Renewable Energy,Guangzhou 510640,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.China Western Energy and Environment Research Center,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

The effects of salinity on anaerobic digestion performance ofLaminariaJaponicawere investigated under the different inoculation rate adopting batch mesophilic experiments.The results indicated that the biogas production performance of the non-washedLaminariaJaponicawere better than that of the washed groups,which the biogas yield was increased by 13%～25%.And the best biogas production of 464.4±0.39 mL·g-1VSaddedand best methane production of 288.28±0.24 mL CH4·g-1VSaddedwere obtained for the non-washedLaminariaJaponicaunder condition of salinity concentration of 12.96 g·L-1,and K+,Mg2+,Ca2+,Na+concentration of 4780 mg·L-1,250 mg·L-1,130 mg·L-1and 1600 mg·L-1respectively.It showed that the suitable concentration of inorganic salt was beneficial to the gas production performance.

LaminariaJaponica; inoculation rate; salinity; anaerobic digestion; methane

2016-01-27

項目來源：國家高技術研究發展計劃(863計劃)( 2012AA101802)；中國科學院重點部署項目資助(KGZD-EW-304-1)；廣東省科技計劃項目(2015B020215011)；廣州市科技計劃項目(201508020098)

張 毅(1990-)，男，博士生，主要從事生物質能源生化轉化研究工作，E-mail：zhangyi@ms.giec.ac.cn

孔曉英，E-mail：kongxy@ms.giec.ac.cn

S216.4

A

1000-1166(2016)03-0003-06