新疆阿魏乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤的抑制作用Δ

羅福祥，盧 軍，張海英，#，雷亞江，張洪平，（.新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊 830000；.新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部藥理實驗室，烏魯木齊 830000）

·民族醫藥·

新疆阿魏乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤的抑制作用Δ

羅福祥1＊，盧 軍2，張海英1，2#，雷亞江1，張洪平1，2（1.新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部藥理實驗室，烏魯木齊 830000）

目的：研究新疆阿魏藥材乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤的抑制作用。方法：將60只小鼠隨機分為正常對照組，腫瘤模型組，阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組（1.0、2.0、3.0 g/kg，ig），順鉑對照組（陽性藥物，5 mg/kg，iv），每組10只。除正常對照組外，其余各組小鼠接種經S180實體瘤侵染的小鼠的腹水以復制S180實體瘤動物模型。造模次日，各給藥組小鼠給予相應藥物，正常對照組、腫瘤模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續10 d。觀察并測定各組小鼠體質量、臟器（脾、胸腺）指數、腫瘤體積變化趨勢、實體瘤塊體積和質量、腫瘤抑制率和病理變化；酶聯免疫吸附法（ELISA）測定小鼠血清白細胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結果：與正常對照組比較，腫瘤模型組小鼠脾指數、TNF-α水平顯著升高，IL-2、IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）；腫瘤組織異型細胞呈團塊狀分布，伴有一定數量的缺血性壞死。與腫瘤模型組比較，順鉑對照組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數、實體瘤塊體積和質量顯著降低，IL-2、TNF-α水平顯著升高；阿魏乙酸乙酯部位各劑量組小鼠脾指數、TNF-α水平顯著升高，實體瘤塊體積和質量顯著降低（P＜0.05）；病理觀察腫瘤組織受到不同程度抑制，且順鉑對照組抑制程度最為顯著，腫瘤細胞數量減少，伴有少量壞死和細胞浸潤；順鉑對照組和阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組小鼠的腫瘤抑制率分別為（73.26±4.55）%、（40.34±3.45）%、（50.86±9.34）%、（58.20±3.70）%。結論：阿魏藥材乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤有抑制作用。

維藥；新疆阿魏；乙酸乙酯部位；S180實體瘤；抑瘤作用；小鼠

阿魏為民族傳統常用藥，味苦、辛，性溫，具有殺蟲、散痞、消積之功效[1]。在維吾爾、哈薩克等民族民間常用于蟲積腹痛、腹中痞塊、肉食積滯、瘀血癥瘕、心腹冷痛、脾胃濕寒等癥的治療。研究顯示，阿魏提取物倍半萜香豆素類化合物具有抗病毒[2]、抗血管新生、抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用[3]。本課題前期研究了新疆阿魏各極性部位對腫瘤增殖的影響，結果從細胞層面發現乙酸乙酯部位對腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制作用，同時可促進腫瘤細胞凋亡[4]。體外活性與體內活性雖有一定的關聯性，但上述結論還需要體內實驗驗證，因此需要根據《抗腫瘤藥效學指導原則》對阿魏藥材乙酸乙酯部位抗腫瘤的藥效學進行研究。

白細胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）具有調節機體免疫的作用，在機體抗腫瘤中發揮著重要功能[5-8]。因此，在本研究中筆者選用S180細胞株和昆明種小鼠，將前期體外試驗結果與動物體內實驗相結合，建立S180實體瘤動物模型，研究阿魏藥材乙酸乙酯部位對小鼠S180實體瘤的抑制作用，為其進一步應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；IX71-12FL/PH倒置熒光研究級三目顯微鏡、xMarkTMBio-Rad酶標儀均購自美國Thermo公司。

1.2 藥材與試劑

新疆阿魏藥材（購自新疆伊犁，批號：2012001，由新疆伊犁阿薩克自治州藥檢所檢驗），經新疆自治區中醫院李永和主任藥師鑒定為傘形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M. Shen；順鉑注射液（江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：150901，規格：6 ml∶30 mg）；胎牛血清（FBS）、雙抗鏈霉素混合液（批號：SV30010）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（批號：SH3004201）均購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司，批號：67685TT）；RPMI 1640培養基（美國 Gibco公司，批號：1237839）；小鼠IFN-γ（批號：21E175）、IL-2（批號：21E253）、TNF-α（批號：21E168）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自上海依科賽生物制品有限公司。

1.3 瘤株

小鼠S180細胞株（購自上海中國科學院細胞研究所）。

1.4 動物

70只健康昆明小鼠，♀♂各半，體質量18～22 g，購自新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心動物中心，合格證號：SCXK（新）2005-006。

2 方法

2.1 新疆阿魏乙酸乙酯部位的制備

新疆阿魏藥材400 g，研碎成顆粒狀，用2 000 ml石油醚（沸點：30～60℃）于低于40℃溫度下超聲提取40 min，反復提取3次，合并濾液，過濾，濃縮。60℃干燥至無氣泡產生，即得石油醚部位；加入2 000 ml 95%乙醇超聲提取40 min，過濾，重復相同方法提取3次，合并提取液，減壓濃縮。濃縮的膏液用硅藻土拌樣分散均勻后，用乙酸乙酯超聲萃取5 min，濾過，濾液濃縮干燥即得乙酸乙酯部位。其浸膏得率為15.2%。

2.2 細胞的培養

小鼠S180細胞株接種至含10%FBS的RPMI 1640培養液，于37℃、含5%CO2培養箱中常規培養。待細胞生長狀態良好后，收集細胞混懸液，離心（離心半徑為7 cm，1 000 r/min，下同）3 min，棄去上清液，加生理鹽水稀釋洗滌2次，并將細胞密度稀釋至2×106ml－1后，無菌操作接種于10只小鼠腹腔內，0.4 ml/只，于小鼠腹腔中傳代培養，整個過程在1 h內完成。培養7 d后，接種小鼠腹部膨大，產生腹水。無菌環境抽取小鼠體內乳白色腹水，離心3 min，用生理鹽水清洗，并將細胞密度稀釋為1×107ml－1，即得細胞株溶液。

2.3 分組、造模與給藥

將60只小鼠隨機分為正常對照組，腫瘤模型組，阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組（1.0、2.0、3.0 g/kg，ig給藥，給藥劑量根據預實驗確定），順鉑對照組（5 mg/kg，iv給藥），每組10只。除正常對照組外，其余各組小鼠于左前肢腋下接種“2.2”項下細胞株溶液0.2 ml，并于次日給予相應藥物，正常對照組、腫瘤模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續10 d。

2.4 各組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數的測定

造模及給藥期間，每天觀察并記錄小鼠體質量。末次給藥1 h后，用乙醚麻醉各組小鼠并從頸動脈采血，離心3 min后分離血清，置于－20℃冰箱備用。迅速剝取腋窩皮下實體瘤瘤塊（浸泡在10%中性甲醛溶液中固定）、胸腺、脾臟，用吸水紙吸干水分，稱取質量并計算脾指數和胸腺指數。脾（胸腺）指數（mg/g）＝脾（胸腺）質量（mg）/體質量（g）。

2.5 各組小鼠腫瘤體積的測量

給藥第6 d起，每日用游標卡尺量取并記錄腫瘤的長（a，mm）、寬（b，mm）、高（c，mm）并計算平均腫瘤體積。腫瘤體積（mm3）＝π×a×b×c/6（π為圓周率，取3.14）。

2.6 各組小鼠實體瘤塊體積、質量與抑制率的測定

取“2.4”項下實體瘤瘤塊，用游標卡尺測量并計算實體瘤塊體積，稱取質量并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率（%）＝（腫瘤模型組平均瘤塊質量－給藥組平均瘤塊質量）/腫瘤模型組平均瘤塊質量×100%。

2.7 各組小鼠腫瘤組織病理切片觀察

取“2.4”項下實體瘤瘤塊，常規石蠟包埋，4 mm厚連續切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察病理情況。

2.8 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平測定

取“2.4”項下血清，按ELISA試劑盒說明書操作，測定各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平。

2.9 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對所得數據進行分析。所有數據采用±s表示，當數據符合正態分布且方差齊時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差分析；當數據方差不齊時則先行對數轉換后再使用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數測定結果

與正常對照組比較，腫瘤模型組小鼠體質量、胸腺指數無顯著變化（P＞0.05），脾指數顯著升高（P＜0.05）。與腫瘤模型組比較，順鉑對照組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數顯著降低（P＜0.05）；阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組小鼠體質量、胸腺指數無顯著變化（P＞0.05），脾指數顯著升高（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Body weight，spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠體質量、脾指數、胸腺指數測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Body weight，spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與腫瘤模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，vs.tumor model group，#P＜0.05

胸腺指數，mg/g 2.96±0.38 2.52±0.85 1.39±0.58#2.29±0.84 2.15±0.57 2.00±1.06組別正常對照組腫瘤模型組順鉑對照組阿魏乙酸乙酯部位低劑量組阿魏乙酸乙酯部位中劑量組阿魏乙酸乙酯部位高劑量組體質量，g 33.68±3.74 35.58±3.64 28.86±2.78#34.93±3.96 32.54±4.58 34.90±3.96脾指數，mg/g 2.67±0.73 5.06±1.67＊2.07±0.43#6.87±0.68#8.30±1.09#8.31±0.74#

3.2 各組小鼠腫瘤體積變化趨勢

隨著時間的推移，腫瘤模型組小鼠腋下腫瘤體積呈倍數增長，腫瘤組織生長迅速。與腫瘤模型組比較，順鉑對小鼠腫瘤組織生長的抑制作用最為明顯；阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織的生長均受到不同程度的抑制，且劑量越高，抑制作用越強，詳見表2。

表2 各組小鼠腫瘤體積測量結果（mm3）Tab 2 Tumor volume of mice in each group（mm3）

3.3 各組小鼠實體瘤塊體積、質量與腫瘤抑制率測定結果

造模10 d后，腫瘤模型組小鼠瘤體顯著增大，表明造模成功。與腫瘤模型組比較，順鉑對照組和阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組小鼠瘤體體積、瘤質量顯著降低（P＜0.05），且順鉑對照組降低最為顯著；腫瘤抑制率分別（73.26±4.55）%、（40.34±3.45）%、（50.86±9.34）%、（58.20±3.70）%，詳見表3。

表3 各組小鼠實體瘤塊體積、質量與腫瘤抑制率測定結果（±s，n＝10）Tab 3 Volume and weight of solid tumor，inhibitory rate of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠實體瘤塊體積、質量與腫瘤抑制率測定結果（±s，n＝10）Tab 3 Volume and weight of solid tumor，inhibitory rate of mice in each group（±s，n＝10）

注：與腫瘤模型組比較，#P＜0.05Note：vs.tumor model group，#P＜0.05

腫瘤抑制率，% 73.26±4.55 40.34±3.45 50.86±9.34 58.20±3.70組別腫瘤模型組順鉑對照組阿魏乙酸乙酯部位低劑量組阿魏乙酸乙酯部位中劑量組阿魏乙酸乙酯部位高劑量組瘤體體積，mm31 921.13±325.67 185.57±71.28#991.36±183.58#588.28±146.74#562.50±157.39#瘤質量，g 2.38±0.56 0.64±0.28#1.42±0.23#1.17±0.27#0.99±0.13#

3.4 各組小鼠組織病理切片觀察結果

腫瘤模型組小鼠腫瘤組織可見大量異形細胞呈團塊狀分布，細胞排列密集，病理性核分裂象較多，浸潤較深，至脂肪、肌層等處，血管較豐富，因腫瘤細胞的惡性增殖，腫瘤組織切片中有一定數量的缺血性壞死區域。順鉑對照組小鼠腫瘤組織切片中腫瘤細胞大片壞死，可見腫瘤細胞殘影，且有大量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤。阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組腫瘤細胞數量明顯降低，細胞排列松散，病理性核分裂象少，腫瘤組織中有少量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，腫瘤細胞部分壞死；其中阿魏高劑量組明顯優于低、中劑量組，呈現一定的量效關系。各組小鼠腫瘤組織病理觀察結果見圖2，變化程度見表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織病理變化程度（只，n＝10）Tab 4 Pathological changes of tumor tissue in mice in each group（mice，n＝10）

圖2 各組小鼠組織病理觀察結果（HE，×200）Fig 2 Histopathological observation result of mice in each group（HE，×200）

3.5 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平測定結果

與正常對照組比較，腫瘤模型組小鼠IL-2、IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05），TNF-α水平顯著增高（P＜0.05）。與腫瘤模型組比較，順鉑對照組，阿魏乙酸乙酯部位中、高劑量組小鼠IL-2、IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）；阿魏乙酸乙酯部位低、中、高劑量組小鼠TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），詳見表5。

表5 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）Tab 5 Serum levels of IL-2，IFN-γ and TNF-α of mice in each group（±s，n＝10）

表5 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平測定結果（±s，n＝10）Tab 5 Serum levels of IL-2，IFN-γ and TNF-α of mice in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與腫瘤模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.tumor model group，#P＜0.05

TNF-α，pg/ml 0.36±0.18 1.32±0.60＊11.16±2.12#4.34±1.25#5.66±1.41#11.97±3.64#組別正常對照組腫瘤模型組順鉑對照組阿魏乙酸乙酯部位低劑量組阿魏乙酸乙酯部位中劑量組阿魏乙酸乙酯部位高劑量組IL-2，pg/ml 31.35±6.42 26.34±3.72＊45.00±4.77#34.74±8.98 50.63±7.33#64.70±6.86#IFN-γ，pg/ml 29.17±0.99 26.65±1.87＊26.36±1.48 28.31±2.11 34.68±1.62#39.87±4.22#

4 討論

脾臟與胸腺為機體重要的免疫器官，當體液免疫應答發生時，脾小結增多、增大，巨噬細胞增多，脾內的淋巴細胞增多[9-10]。胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，參與細胞免疫[11]。通過測定胸腺指數不僅可以反映胸腺的功能，還可以間接反映機體的免疫功能[12]。因此可將脾指數和胸腺指數作為衡量機體免疫功能的指標之一。順鉑在抗腫瘤方面應用廣泛、療效顯著，故本研究將其作為陽性藥物。本研究結果顯示，順鉑對照組小鼠胸腺指數顯著降低，表明順鉑在殺傷腫瘤細胞的同時可對機體正常細胞和免疫功能產生影響。阿魏乙酸乙酯部位各劑量組小鼠脾指數增加，胸腺指數無明顯變化，表明阿魏可能是通過促進脾臟功能來增強機體免疫能力的；同時，阿魏也引起了脾臟異常增大，可能是脾功能亢進導致的，但具體原因有待于進一步研究。

IL-2在機體免疫調節和炎癥反應中發揮著重要作用[5]。IFN-γ主要由活化的T細胞和自然殺傷（NK）細胞產生，具有強大的免疫調節作用和抗病毒、抗腫瘤作用[6]。TNF-α在腫瘤中的作用還存在爭議[7-8]，近期研究表明，化療后病情達到完全緩解的患者血清TNF-α水平較初治患者明顯升高，這表明TNF-α的表達水平與化療療效密切相關[13]。本研究結果顯示，阿魏乙酸乙酯部位中、高劑量可顯著升高小鼠血清IL-2、IFN-γ水平，低、中、高劑量可顯著升高TNF-α水平，推測新疆阿魏是通過提高S180實體瘤小鼠免疫功能和TNF-α表達來抑制腫瘤的生長，從而發揮抗腫瘤作用的。

研究表明，順鉑在抗腫瘤的同時對機體正常免疫功能會產生影響，這也是化療藥物的毒副作用之一。本研究結果顯示，與順鉑對照組比較，新疆阿魏乙酸乙酯部位抗S180實體瘤小鼠腫瘤的效果雖然稍差，但其具有增強機體免疫的功能，因此具有獨特的優勢。但是，中藥提取物成分復雜，因此有必要對阿魏乙酸乙酯部位進行進一步的單體分離和活性研究，全面尋找阿魏中的抗腫瘤有效成分，以發揮更好的抗腫瘤作用。

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Inhibitory Effect of Ethyl Acetate Part of Ferula sinkiangensis on S180 Solid Tumor in Mice

LUO Fuxiang1，LU Jun1，ZHANG Haiying1，2，LEI Yajiang1，ZHANG Hongping1，2（1.School of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China；2.Laboratory of Pharmacology，School of Pharmacy，Affiliated Chinese Medicine Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China）

OBJECTIVE：To study the inhibitory effect of ethyl acetate part from Ferula sinkiangensis on S180 solid tumor in mice．METHODS：60 mice were randomly divided into normal control group，tumor model group，ethyl acetate part of F.sinkiangensis low-dose，middle-dose and high-dose groups（1.0，2.0，3.0 g/kg，ig），cisplatin control group（positive drug，5 mg/kg，iv），with 10 mice in each group.Except for normal control group，other groups were given mice ascites infected by S180 solid tumor to induce S180 solid tumor model.The next day after modeling，those groups were given relevant medicine，and normal control group and tumor model group were given constant volume of normal saline，once a day，for consecutive 10 days.Body weight，organ（spleen，thymus）index，the change of tumor volume，volume and weight of solid tumor，inhibitory rate of tumor and pathological change were observed in each group.ELISA method was used to determined the serum levels of IL-2，IFN-γ and TNF-α.RESULTS：Compared with normal control group，spleen index and TNF-α of tumor model group were increased significantly，while IL-2 and IFN-γ were decreased significantly（P＜0.05）；dysplastic cells of tumor tissue appeared lumpy，accompanied by a number of ischemic necrosis of dysplastic cells.Compared with tumor model group，body weight，spleen index，thymus index and volume and weight of solid tumor in cisplatin control group were decreased significantly，while IL-2 and TNF-α levels were increased significantly.The spleen index and TNF-α level of ethyl acetate part of F.sinkiangensis groups were increased significantly，while the volume and weight of solid tumor were decreased significantly（P＜0.05）.The tumor tissue was inhibited to different extents，especially in cisplatin control group；the number of tumor cells was decreased，accompanied by small number of cellular necrosis and infiltration.Inhibitory rates of cisplatin control group，ethyl acetate part of F.sinkiangensis groups were（73.26±4.55）%，（40.34±3.45）%，（50.86±9.34）%，（58.20±3.70）%，respectively.CONCLUSIONS：ethyl acetate part of F.sinkiangensis can inhibit S180 solid tumor in mice.

Uygur medicine；Ferula sinkiangensis；Ethyl acetate part；S180 solid tumor；Tumor inhibitory effect；Mice

R285.5

A

1001-0408（2016）31-4388-04

2016-04-16

2016-08-11）

（編輯：劉明偉）

國家自然科學基金資助項目（No.81260625）

＊碩士研究生。研究方向：中藥與民族藥藥理。電話：0991-5814127。E-mail：1341329265@qq.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：中藥與民族藥藥理。電話：0991-5814127。E-mail：1030737878@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.21