四角菱莖多酚的超聲提取工藝優(yōu)化及體外抗腫瘤活性研究Δ

李 峰，王延偉，俞力超，湯 建，徐秀泉#（.江蘇大學附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇鎮(zhèn)江 00；.江蘇大學藥學院制藥工程系，江蘇鎮(zhèn)江 03）

四角菱莖多酚的超聲提取工藝優(yōu)化及體外抗腫瘤活性研究Δ

李 峰1＊，王延偉2，俞力超1，湯 建2，徐秀泉2#（1.江蘇大學附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學藥學院制藥工程系，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

目的：優(yōu)化四角菱莖中多酚的超聲提取工藝并考察其體外抗腫瘤活性。方法：以多酚得率為因變量，以乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比為自變量，采用Box-Behnken設計的響應面法優(yōu)化四角菱莖中多酚的超聲提取工藝；采用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度的四角菱莖多酚對人宮頸癌HeLa細胞、人膠質(zhì)瘤U251細胞、人肝癌HepG2細胞體外增殖的影響，計算其半數(shù)抑制濃度（IC50），并觀察細胞的形態(tài)變化。結(jié)果：最優(yōu)超聲提取工藝為液料比34，45%乙醇，在50℃下超聲提取24 min。在此優(yōu)化條件下多酚得率為29.36 mg/g（RSD＝0.72%，n＝3），與模型預測值29.89 mg/g的相對誤差為1.77%。四角菱莖多酚對HeLa、U251、HepG2細胞均具有明顯的增殖抑制作用，IC50分別為166.2、141.7、126.6 μg/ml，并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，且各細胞均出現(xiàn)一定程度的凋亡形態(tài)。結(jié)論：響應面法優(yōu)化所得四角菱莖多酚超聲提取工藝方法簡單、預測性良好；四角菱莖多酚具有較好的體外抗腫瘤活性。

四角菱莖；多酚；超聲提取；Box-Behnken設計；響應面法；體外抗腫瘤活性

四角菱（Trapa natans L.Var.incisa Makino）為一年水生草本植物，屬菱科、菱屬，主要分布于我國山東、湖北、江蘇等湖網(wǎng)密集地區(qū)[1]，其果實稱為菱角。《本草綱目》記載：“菱角具有補脾胃，強股膝，健力益氣等功效”[2]，是藥食兩用的佳品。但是菱角食用時只選用菱肉部分，菱角殼常被丟棄，而四角菱莖僅限于食用，并未得到有效利用。近來研究發(fā)現(xiàn)，四角菱角殼醇提取物和水提取物均具有顯著抗氧化及抑制腫瘤細胞增殖的作用，且其作用大小與其中多酚類化合物含量密切相關(guān)[3-4]。雖然目前菱角殼的活性已得到了科研工作者的重視，但是四角菱的菱莖卻還未引起人們的注意。筆者前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四角菱莖中富含多酚類化合物，值得深入研究。本試驗即以多酚得率為因變量，乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比為自變量，采用響應面法優(yōu)化四角菱莖中多酚的提取工藝，并對多酚的體外抗腫瘤活性進行初步研究，為四角菱的深入開發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2660紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-250DB超聲波儀（昆明市超聲儀器有限公司）；BS 110 S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TS100 Nikon倒置相差顯微鏡（日本尼康公司）；Spectra Max 190酶標儀（美國Molecular Device公司）。

1.2 藥材、試劑與細胞株

四角菱莖（2014年9月購自山東省微山湖商貿(mào)有限公司，經(jīng)江蘇大學藥學院湯建副教授鑒定為菱科菱屬四角菱的干燥莖葉，粉碎過40目篩備用）；沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：1110831-201204，供含量測定用）；胰蛋白酶、青霉素、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、鏈霉素（美國Amresco公司，均為分析純，純度：＞99.5%）；MEM、1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；MTT、5-氟尿嘧啶（5-FU，美國Sigma公司，純度：＞98.0%）；小牛血清、胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；二甲基亞砜（DMSO）等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

人肝癌HepG2細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人腦膠質(zhì)瘤U251細胞由江蘇大學藥學院高靜教授惠贈。

2 方法與結(jié)果

2.1 多酚含量測定

2.1.1 多酚標準曲線的繪制[5]精密稱取干燥至恒質(zhì)量的沒食子酸10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加乙醇適量溶解，定容至刻度，搖勻，取上述溶液2.5 ml定容至25 ml，即得100 μg/ml沒食子酸對照品溶液。精密量取不同體積該溶液置于10 ml量瓶中，依次加入Folin-Ciocalteu試劑0.5 ml，振搖1 min，加入20%Na2CO3溶液2 ml，振搖1 min，然后加雙蒸水至刻度，室溫放置60 min。以雙蒸水為空白對照，于760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度（c）對吸光度（A）進行線性回歸，得線性方程為A＝0.014 3c+0.002（r＝0.999 6），沒食子酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～80 μg/ml。精密度和重復性試驗的RSD分別為0.82%、1.36%（n＝6），穩(wěn)定性試驗中供試品在24 h內(nèi)吸光度的RSD為1.24%（n＝6），加樣回收率試驗中平均回收率為98.62%（RSD＝2.05%，n＝6）。上述結(jié)果表明采用此含量測定方法測定多酚含量，可滿足樣品檢測的要求。

2.1.2 四角菱莖多酚的提取及得率的測定 精確稱取2.0 g四角菱莖粉末，加入一定體積分數(shù)和體積的乙醇溶液，一定溫度下超聲波（超聲功率200 W，頻率40 kHz）提取一定時間，過濾，定容至50 ml。將該溶液稀釋至一定倍數(shù)后，精密量取1 ml，按“2.1.1”項下方法測定吸光度，計算多酚得率[提取出的多酚質(zhì)量（mg）/四角菱莖質(zhì)量（g）]。

2.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 試驗設計 在單因素預試驗基礎上，結(jié)合中心組合設計原理，以乙醇體積分數(shù)（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）3個因素為自變量，以多酚得率（Y）為因變量，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken進行試驗設計。各因素與水平見表1，試驗設計與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

2.2.2 建立模型方程與顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0.5軟件對表1中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合分析，得到多酚得率隨各因素變化的回歸方程為：Y＝29.37－0.30X1+0.14X2+ 0.71X3－0.40X1X2－1.10X1X3－1.18X2X3－1.12X12－1.25X22－0.95X32。對回歸模型方程進行顯著性方差分析檢驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型P＝0.002 3（P＜0.01），失擬項0.05＜P＜0.655 8，表明因變量與各自變量之間多元回歸關(guān)系高度顯著，數(shù)據(jù)擬合效果較好，模型能夠較好地反映真實試驗值。模型的調(diào)整確定系數(shù)Radj2＝0.921 8，表明該模型能夠解釋92.18%試驗數(shù)據(jù)的變異性，證明應用響應面法優(yōu)化的提取工藝提取四角菱角莖多酚是可行的。由P值可看出各因素對多酚得率的影響順序依次為X3＞X1＞X2。交互項X1X3、X2X3對多酚得率有高度顯著影響，X1X2影響不顯著。二次項中3個因素均對多酚得率有高度顯著影響，這表明各因素對多酚得率的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系。

表2 試驗設計與結(jié)果Tab 2 Experimental design and result

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis results of regression model

2.2.3 響應面分析及最優(yōu)提取條件的確定 根據(jù)回歸方程，采用Design-Expert 8.0.5軟件繪制各因素的響應面圖，見圖1。

由圖1可見，響應面的曲面坡度平緩，說明提取因素對多酚得率影響較小；坡度陡峭，說明對多酚得率影響較大[6]。另外，X3對多酚提取得率影響顯著，表現(xiàn)為曲面坡度陡峭，這與方差分析結(jié)果一致。多酚得率隨乙醇體積分數(shù)、液料比的提高及提取時間的延長，先增加后降低。這可以解釋為不同體積分數(shù)乙醇的極性不同，根據(jù)“相似相溶”的原則，只有某一定體積分數(shù)乙醇極性與多酚極性相近時，才能得到最大程度的溶出。液料比增大到一定值，再增加液料比將會減少單位體積所獲得的超聲能量，提取時間延長可能會導致多酚類化合物的氧化降解[7-8]。所以只有在適當?shù)囊毫媳群统曁崛r間內(nèi)多酚得率才能達到最高值。

2.2.4 最優(yōu)工藝的確定與驗證試驗 根據(jù)所得模型，預測四角菱莖多酚最優(yōu)提取條件為：液料比34，固定超聲功率200 W，頻率40 kHz，溫度50℃，以45%乙醇提取24 min；預測多酚得率為29.89 mg/g。準確稱取四角菱莖20.00 g，按此提取條件重復試驗3次，求得其平均得率為29.36 mg/g（RSD＝0.72%，n＝3），實際值與預測值的相對誤差為1.77%（小于2%），充分驗證了所建模型的可行性。

圖1 各因素對多酚得率影響的響應面圖Fig 1 Response surface plot for the effect of each factor on the yield of polyphenol

2.3 四角菱莖多酚體外抗腫瘤活性分析

2.3.1 MTT法檢測四角菱莖多酚的體外抗腫瘤細胞增殖活性[9]取不同對數(shù)生長期腫瘤細胞HeLa、U251和HepG2，胰酶消化、計數(shù)后，以4×104ml－1的密度，每孔100 μl接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，將經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化的四角菱莖多酚及陽性對照5-FU（用DMSO制備成質(zhì)量濃度均為500、250、125、62.5 μg/ml的溶液）處理腫瘤細胞。24 h后棄去上清液，加入1 mg/ml的MTT 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μl DMSO，振蕩混勻，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度。計算抑制率[（陰性對照組吸光度－給藥組吸光度）/（陰性對照組吸光度－空白組吸光度）×100%，其中陰性對照組為不加藥物組，空白組為只加入培養(yǎng)基組]和半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度四角菱莖多酚和5-FU對3種腫瘤細胞的增殖抑制率Fig 2 Effects of different concentrations of polyphenol from the stem of T.natans and 5-FU on the proliferation inhibition rate of 3 kinds of tumor cells

由圖2可知，不同質(zhì)量濃度四角菱莖多酚對3種腫瘤細胞的增殖均具有明顯的抑制作用，作用24 h后對HeLa、U251和HepG2細胞的IC50值分別為166.2、141.7、126.6 μg/ml，接近或者低于5-FU的143.27、159.45、174.68 μg/ml，且均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。四角菱莖多酚對各細胞的增殖抑制作用無明顯差異，表明其具有較廣譜的體外抗腫瘤活性。

2.3.2 四角菱莖多酚對腫瘤細胞形態(tài)的影響 由“2.3.1”項試驗結(jié)果可知，250 μg/ml的多酚具有中等強度的抗腫瘤活性。為便于觀察細胞形態(tài)，選取此質(zhì)量濃度下的四角菱角莖多酚作用于不同腫瘤細胞24 h，倒置相差顯微鏡觀察此質(zhì)量濃度組與“2.3.1”項下陰性對照組細胞的生長情況及形態(tài)變化，結(jié)果見圖3。

圖3 四角菱莖多酚作用于3種細胞24 h后腫瘤細胞形態(tài)的變化Fig 3 Morphologic changes of 3 kinds of tumor cells after treated with polyphenol from the stem of T.natans for 24 h

由圖3可知，未加藥物的陰性對照組細胞貼壁生長，外形完整、規(guī)則、整齊。與陰性對照組比較，四角菱莖多酚處理24 h后的細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變：細胞貼壁能力下降，細胞皺縮變圓，細胞間距明顯變大，細胞數(shù)目顯著減少。這表明四角菱莖多酚能夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖，并在一定程度上誘導細胞的凋亡，再次說明其具有良好的體外抗腫瘤活性。

3 討論

多酚是廣泛存在于植物中且富含酚羥基的一大類化合物，目前已知的植物酚類物質(zhì)超過8 000種上。該類化合物結(jié)構(gòu)中的酚羥基使其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理活性，但同時也導致了其在提取過程中的不穩(wěn)定性[10]。傳統(tǒng)的加熱回流提取過程溫度高、提取時間長，很容易造成多酚類化合物的氧化，降低提取得率及多酚生理活性[11]。超聲輔助提取技術(shù)因其提取時間短、溫度低等優(yōu)點能夠較大程度地避免多酚類化合物在提取過程中的氧化和降解，近年來得到了廣泛的應用[12]。

響應面法是采用多元二次回歸方程來擬合各因素與響應值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法，特別適合于各因素之間有相互影響的復雜試驗條件的優(yōu)化。本試驗采用超聲輔助提取法，利用超聲波的機械效應、空化效應和熱效應，能夠有效促進四角菱莖細胞壁的破裂，加速溶劑進入植物細胞，促使多酚成分的溶出，大大縮短提取時間，降低能量消耗。通過Box-Behnken設計的響應面法，優(yōu)化工藝得到的四角菱莖多酚得率與理論預測值基本吻合，確認利用該法得到的超聲提取工藝具有一定的實用價值，從而為四角菱莖多酚的綜合開發(fā)利用提供了參考。

四角菱莖在我國南方多數(shù)地區(qū)作為一種可供食用的綠色蔬菜，還未有其化學成分及生理活性的相關(guān)文獻報道。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，四角菱莖多酚對HeLa、U251和HepG2等腫瘤細胞具有良好的體外增殖抑制作用，并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。本試驗結(jié)果為開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物提供了一定的試驗依據(jù)。

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Optimization of Ultrasonic Extraction Technology of Polyphenol from the Stem of Trapa natans and Study on Its in vitro Antitumor Activities

LI Feng1，WANG Yanwei2，YU Lichao1，TANG Jian2，XU Xiuquan2（1.Dept.of Cardiothoracic Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212001，China；2.Dept.of Pharmaceutical Engineering，School of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China）

OBJECTIVE：To optimize the ultrasonic extraction technology of polyphenol from the stem of Trapa natans and conduct in vitro antitumor activity test.METHODS：Using the yield of polyphenol as dependent variable，ethanol concentration，extraction time and liquid-material ratio as independent variables，the ultrasonic extraction technology of polyphenol from the stem of T.natans was optimized by response surface methodology designed by Box-Behnken design.The effects of different concentrations of polyphenol from the stem of T.natans on the proliferation of HeLa cells，U251 cells and HepG2 cells were detected by MTT assay，IC50were calculated，and morphologic changes of them were observed.RESULTS：The optimal condition as follows as the liquid-material ratio was 34，45%ethanol，ultrasonic extracting for 24 min at 50℃.Under this condition，the yield of polyphenol was 29.36 mg/g（RSD＝0.72%，n＝3），the relative error of which from predicted value 29.89 mg/g was 1.77%.The proliferation of HeLa cells，U251 cells and HepG2 tumor cells were all significantly inhibited by polyphenol with IC50of 166.2，141.7，126.6 μg/ml，showing good dose-effect relationship.The apoptosis of those cells was presented to certain extent.CONCLUSIONS：Optimized ultrasonic extraction technology of polyphenol from the stem of T.natans by response surface methodology is simple and predictable.The polyphenol from the stem of T.natans has significant anti-tumor effect in vitro.

Stem of Trapa natans；Polyphenol；Ultrasonic extraction；Box-Behnken design；Response surface methodology；Antitumor activity in vitro

R284.2；R285.5

A

1001-0408（2016）31-4414-04

2016-01-12

2016-06-12）

（編輯：劉 萍）

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目（No.LZ13244）

＊副主任醫(yī)師，博士研究生。研究方向：天然產(chǎn)物活性分析。E-mail：lifengjs@163.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：天然產(chǎn)物活性分析。電話：0511-85038201。E-mail：xxq781026@ujs.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.28