HPLC法同時測定藏藥獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的含量

乙永林，孫連先（1.連云港市疾病預防控制中心，江蘇連云港 003；.連云港市第二人民醫院，江蘇 連云港 03）

HPLC法同時測定藏藥獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的含量

乙永林1＊，孫連先2（1.連云港市疾病預防控制中心，江蘇連云港 222003；2.連云港市第二人民醫院，江蘇 連云港 222023）

目的：建立同時測定獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonds C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為238 nm（山梔苷甲酯）、348 nm（木犀草素、芹菜素），柱溫為25℃，進樣量為10 μl。結果：山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素檢測質量濃度線性范圍分別3.08～308 μg/ml（r＝0.999 8）、3.72～372 μg/ml（r＝0.999 9）、2.92～292 μg/ml（r＝0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為95.38%～103.15%（RSD＝1.85%，n＝9）、96.05%～102.66%（RSD＝2.07%，n＝9）、95.49%～103.59%（RSD＝2.18%，n＝9）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的同時測定。

獨一味；山梔苷甲酯；木犀草素；芹菜素；含量；高效液相色譜法

獨一味為唇形科植物獨一味Lamiophlomis rotate（Benth.）Kudo的干燥地上部分[1]，藏語又稱“大巴”“打布巴”，在我國四川、青海、甘肅、西藏等地區廣泛分布，常于9～10月采收，以根及根狀莖入藥，味苦，微寒，有小毒，可補髓、止血[2]。臨床上主要用于急性軟組織損傷、關節炎、腰椎間盤突出等癥的治療。

獨一味含有多種有效成分，如黃酮類、環烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、總環烯醚萜苷等，其中黃酮類成分和苯乙醇苷類成分具有良好的鎮痛作用[3]；環烯醚萜苷類具有顯著的抗炎作用[4-5]；總環烯醚萜苷具有吸水特性，因此對小鼠斷尾出血、兔腹主動脈出血、兔耳中動脈出血和大鼠肝臟組織損傷出血有很好的止血作用[6-8]。近年來，由于對獨一味的需求日益加大，其質量控制標準也日趨嚴格，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立同時測定其中獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的方法，以為獨一味藥材的質量標準研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

600型HPLC儀，包括2487雙通道紫外檢測器、Millennium32色譜工作站（美國Waters公司）；BS224S型分析天平（德國Satorius公司）。

1.2 試劑

山梔苷甲酯對照品（批號：111873-201101，純度＞98%）、木犀草素對照品（批號：111520-201204，純度＞98%）、芹菜素對照品（批號：111901-201205，純度＞98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

獨一味藥材購自南京醫科大學附屬淮安第一醫院中藥房，由連云港市第二人民醫院孫連先副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamonds C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B，含1 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨），梯度洗脫（0～12 min，10%A；12～20 min，10%→18.5% A）；檢測波長：238 nm（山梔苷甲酯）、348 nm（木犀草素、芹菜素）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；進樣量：10 μl。記錄色譜，詳見圖1。在上述色譜條件下，理論板數以山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰計分別為4 500、5 200、6 500；各成分基線分離良好，分離度＞1.5。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.山梔苷甲酯；2.木犀草素；3.芹菜素；Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；1.dipsacoside；2.luteolin；3. apigenin

2.2.1 混合對照品溶液 稱取減壓干燥至恒質量的山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素對照品適量，加60%甲醇制成山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素質量濃度分別為0.308、0.372、0.292 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品藥材粉末（過2號篩）約0.5 g，精密稱定，加60%甲醇40 ml，稱定質量，回流提取60 min，冷卻后以60%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 ml，分別加60%甲醇稀釋至100、80、60、40、20、1 ml，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為y＝16.379x+0.461 2（r＝0.999 8）、y＝22.435x+0.396 4（r＝0.999 9）、y＝38.598x+0.528 6（r＝0.999 9）。結果表明，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素檢測質量濃度線性范圍分別為3.08～308、3.72～372、2.92～292 μg/ml。

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.52%、2.07%、2.75%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.61%、2.07%、1.82%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內基本穩定

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素的平均含量分別為4.683、8.457、3.274 mg/g，RSD分別為1.32%、1.87%、2.43%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量樣品適量，共6份，分別加入高、中、低質量的山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 流動相的考察

黃酮類成分大多含有酚羥基，極性較大，且容易以離子形式存在，色譜峰容易拖尾且保留值太小。因此，本試驗在流動相中加入了十六烷基三甲基溴化銨離子對試劑，使樣品離子在流動相中與離子對試劑的反離子生成無荷電的疏水性離子對，從而改善峰形和分離度。

3.2 檢測波長的考察

筆者分別對3個被測成分進行190～400 nm全波長掃描，結果表明，山梔苷甲酯最大吸收波長為238 nm，木犀草素最大吸收波長為254、354 nm，芹菜素最大吸收波長為258、342 nm，由于在238 nm波長處木犀草素和芹菜素的含量很低，而348 nm波長處可更好地測定木犀草素和芹菜素的含量，因此本試驗設置兩個波長來檢測3個成分的含量。

3.3 供試品提取方法的考察

在預試驗中，筆者分別考察了不同提取方式（水回流提取法、水提醇沉提取法）、不同體積分數甲醇（100%、80%、60%、40%）、不同料液比（1∶160、1∶80、1∶40、1∶20）和不同提取時間（30、60、90 min）。結果表明，0.5 g藥材粉末中加60%甲醇40 ml，回流提取60 min時有效成分含量較高。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于獨一味中山梔苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量的同時測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：262.

[2] 青海高原生物研究所植物室.青藏高原藥物圖鑒[M].西寧：青海人民出版社，1978：108.

[3] 張鳳，孫連娜，陳萬生.不同產地獨一味中苯乙醇苷類的含量測定與品質評價[J].中國中藥雜志，2008，33（11）：1 346.

[4] 朱斌，龔念，彭崇勝，等.獨一味鎮痛作用及其有效成分研究[J].中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（3）：442.

[5] Zhang F，Wu ZJ，Sun LN，et al.Iridoid glucosides and a C13-norisoprenoid from Lamiophlomis rotata and their effects on NF-κ B activation[J].Bioorg Med Chem Lett，2012，22（13）：4 447.

[6] 汪茜，孫秋艷，楊婷，等.獨一味巴布膏抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床，2010，26（1）：49.

[7] 張泉龍，邱建國，李茂星，等.獨一味環烯醚萜苷外用止血作用研究[J].醫藥導報，2011，30（7）：877.

[8] Li M，Jia Z，Hu Z，et al.Experimental study on the hemostatic hemostatic activity of the Tibetan medicinal herb Lamiophlomis rotate[J].Phytother Res，2008，22（6）：759.

（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of Dipsacoside B，Luteolin and Apigenin in Zang Medicine Lamiophlomis rotata by HPLC

YI Yonglin1，SUN Lianxian2（1.Center for Disease Control and Prevention of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222003，China；2.The Second People's Hospital of Lianyungang，Jiangsu Lianyungang 222023，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of dipsacoside B，luteolin and apigenin in Zang medicine Lamiophlomis rotata.METHODS：HPLC was performed on the column of Diamonds C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 238 nm for dipsacoside B，348 nm for luteolin and apigenin，column temperature was 25℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 3.08-308 μg/ml for dipsacoside B（r＝0.999 8），3.72-372 μg/ml for luteolin（r＝0.999 9）and 2.92-292 μg/ml for apigenin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 95.38%-103.15%（RSD＝1.85%，n＝9），96.05%-102.66%（RSD＝2.07%，n＝9）and 95.49%-103.59%（RSD＝2.18%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of dipsacoside B，luteolin and apigenin in Zang medicine L.rotata.

Lamiophlomis rotata；Dipsacoside B；Luteolin；Apigenin；Content；HPLC

R927

A

1001-0408（2016）33-4733-03

2016-06-22

2016-09-13）

＊副主任藥師。研究方向：醫院藥學。E-mail：lygyyl@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.42