HPLC-ELSD法測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量

李志得，張彩云，汪 霞（鄂州市食品藥品檢驗檢測中心，湖北鄂州 436099）

HPLC-ELSD法測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量

李志得＊，張彩云，汪 霞（鄂州市食品藥品檢驗檢測中心，湖北鄂州 436099）

目的：建立高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素含量的方法。方法：色譜柱為Dikma-C18，流動相為乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V），流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，進樣量為10 μl。結果：琥乙紅霉素檢測進樣量線性范圍為1.216～7.296 μg（r＝0.999 2）；定量限為0.304 μg，檢測限為0.076 μg；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率為97.59%～104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）。結論：該方法操作簡便、結果準確、靈敏度高、重復性好，可用于測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量。

琥乙紅霉素片；高效液相色譜法；琥乙紅霉素；含量測定

琥乙紅霉素屬大環內酯類抗菌藥物，為紅霉素的琥珀酸乙酯，具有廣譜抗菌作用。2015年版《中國藥典》（二部）采用水解琥乙紅霉素后，用微生物檢定法測定其含量[1]，此試驗過程復雜、操作煩瑣、影響因素多、重復性較差[2]。目前，現有文獻多采用高效液相色譜法（HPLC）測定琥乙紅霉素的含量[3-6]，均采用紫外檢測器，檢測波長為210 nm左右；而琥乙紅霉素僅在紫外末端有吸收，因此此試驗靈敏度低。為盡量減小紫外末端吸收引起的基線干擾，筆者采用HPLC-蒸發光散射檢測器（ELSD）法，建立了測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素含量的方法，以期為控制該制劑的質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2424蒸發光散射檢測器、e2695泵、Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-3000型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz）；BS21S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

琥乙紅霉素片（西安利君制藥有限責任公司，批號：1402052、1311474、1403016，規格：0.125 g/片）；琥乙紅霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130425-200002，純度＞98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取琥乙紅霉素對照品0.030 40 g，置于25 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙紅霉素1.216 mg的溶液，作為對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液4.0 ml，置于10 ml量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成每1 ml含琥乙紅霉素0.486 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10片，精密稱定，研細，混勻，精密稱取適量（約相當于琥乙紅霉素35 mg），置于100 ml量瓶中，加乙腈溶解，超聲處理10 min，放冷，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方工藝和配方比例，取不含琥乙紅霉素的輔料制備陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，琥乙紅霉素與其他雜質峰均能達到基線分離，分離度＞2.0；理論板數以琥乙紅霉素峰計＞5 000，保留時間為10 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.琥乙紅霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.erythromycin ethylsuccinate

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加乙腈定容，搖勻，即得系列對照品溶液。分別精密量取上述系列對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以琥乙紅霉素進樣量的對數值為橫坐標（x）、峰面積的對數值為縱坐標（y）進行線性回歸，得琥乙紅霉素對數值的回歸方程為y＝1.100 5x+6.606 1（r＝0.999 2）。結果表明，琥乙紅霉素峰面積的對數值與進樣量的對數值線性關系良好，琥乙紅霉素檢測進樣量線性范圍為1.216～7.296 μg。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限。結果，琥乙紅霉素的定量限為0.304 μg，檢測限為0.076 μg。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，琥乙紅霉素峰面積的RSD＝0.92%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密量取同一供試品溶液（批號：1402052）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，琥乙紅霉素峰面積的RSD＝1.08%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號：1402052）適量，精密稱定，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，琥乙紅霉素的平均含量為98.4%，RSD＝0.84%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：1402052）6份，研細，精密稱取適量（約相當于琥乙紅霉素9 mg），分別精密加入琥乙紅霉素對照品9 mg，置于50 ml量瓶中，加乙腈適量，超聲處理10 min，放冷，加乙腈定容，搖勻，濾過，取續濾液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按兩點外標法計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

目前，琥乙紅霉素的測定方法主要有生物檢定法[1]、HPLC法[3-6]，紫外分光光度法[7-10]、電化學法[11-12]等。亦有用HPLC法測定琥乙紅霉素中游離紅霉素[13]、HPLC-串聯質譜法測定琥乙紅霉素顆粒體內活性代謝物的報道[14]，但上述方法靈敏度低。因此，筆者采用ELSD，可提高檢測的靈敏度。

3.2 溶劑和流動相的選擇

試驗中曾用流動相作為溶劑溶解對照品和樣品，但穩定性較差。筆者參考相關文獻[4]經過多次試驗比較，發現采用乙腈作為溶劑溶解樣品，在24 h內具有良好的穩定性。故本試驗選擇乙腈作為溶劑。關于流動相的選擇，筆者曾用乙腈-水、乙腈-乙酸銨緩沖液等作為流動相，結果色譜不出峰或峰形極差，改用乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）后，色譜峰形理想，保留時間合適，理論板數按琥乙紅霉素峰計達到5 000以上。因此，本試驗最終選擇乙腈-0.05%二乙胺（70∶30，V/V）作為流動相。

綜上所述，本方法操作簡便、結果準確、靈敏度高、重復性好，可用于測定琥乙紅霉素片中琥乙紅霉素的含量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：1 246.

[2] 李夏林，張麗英.管碟法測定琥乙紅霉素含量的不確定度分析[J].中國醫藥導報，2011，8（12）：42.

[3] 宋金春，于龍環.HPLC法測定琥乙紅霉素靜脈乳劑的含量[J].中國藥師，2013，16（5）：675.

[4] 陳燕，劉虹，趙海鵬.高效液相色譜法測定琥乙紅霉素片的含量[J].中國藥品標準，2015，16（2）：130.

[5] 劉雅琴，趙曉頔，王偉娜，等.琥乙紅霉素片含量測定方法的改進[J].中國藥師，2012，15（4）：510.

[6] 簡永耀，靳龍文.HPLC法測定琥乙紅霉素片的含量[J].安徽醫藥，2008，12（8）：692.

[7] 王紅專，林冰，袁竹青，等.電荷轉移分光光度法測定琥乙紅霉素[J].河南化工，2015（6）：52.

[8] 王曉玲，張萍，陳燕.甲基紅褪色光度法測定琥乙紅霉素[J].應用化工，2014，43（9）：1 712.

[9] 胡小明，彭勤龍.琥乙紅霉素與甲基紅的荷移反應研究[J].分析科學學報，2015，31（5）：701.

[10] 陳蓮惠，謝夢，葉莉，等.甲基綠褪色光度法測定琥乙紅霉素[J].分析試驗室，2014（2）：187.

[11] 任艷艷，金根娣，胡效亞.琥乙紅霉素在碳糊電極上的電化學測定方法[J].應用化學，2011，28（6）：704.

[12] 王偉峰，潘玉瑩，楊梅霞，等.毛細管電泳-化學修飾電極電致化學發光法測定琥乙紅霉素[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：1 900.

[13] 羅慧萍，易秋艷，王燦，等.HPLC法測定琥乙紅霉素中游離紅霉素的含量[J].藥物分析雜志，2014，34（12）：2 264.

[14] 王愛華，劉天揚，楊楊，等.HPLC-MS/MS法測定琥乙紅霉素顆粒體內活性代謝物[J].藥物分析雜志，2011，31（3）：448.

（編輯：劉 柳）

Content Determination of Erythromycin Ethylsuccinate in Erythromycin Ethylsuccinate Tablet by HPLCELSD

LI Zhide，ZHANG Caiyun，WANG Xia（Ezhou Center for Food and Drug Control，Hubei Ezhou 436099，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of erythromycin ethylsuccinate in Erythromycin ethylsuccinate tablet.METHODS：The column of Dikma-C18with mobile phase of acetonitrile-0.05%diethylamine（70∶30，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μl.RESULTS：The linear range of erythromycin ethylsuccinate was 1.216-7.296 μg（r＝0.999 2）；limit of quantitation was 0.304 μg，the limits of detection was 0.076 μg，respectively；the RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 2.0%，the average recoveries was 97.59%-104.19%（RSD＝1.71%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate with high sensitivity and reproducibility，and can be used for the content determination of Erythromycin ethylsuccinate tablet.

Erythromycin ethylsuccinate tablet；HPLC；Erythromylin ethyisuccinate；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4744-03

2015-11-30

2016-05-16）

＊副主任技師。研究方向：抗菌藥物及中藥檢驗。電話：0711-3863027。E-mail：Lzd-5@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.46