NF-κB和eIF4E在子宮內膜上皮內瘤變和子宮內膜樣癌中的表達及意義

趙慶慶，宋文靜

（天津醫科大學病理學教研室，天津300070）

論著

NF-κB和eIF4E在子宮內膜上皮內瘤變和子宮內膜樣癌中的表達及意義

趙慶慶，宋文靜

（天津醫科大學病理學教研室，天津300070）

目的：探討核轉錄因子-κB（NF-κB）和eIF4E在子宮內膜上皮內瘤變（EIN）和子宮內膜樣癌（EC）中的表達規律及意義。方法：免疫組織化學SP法檢測NF-κB和eIF4E在增殖期子宮內膜、子宮內膜增生、EIN及EC中的表達，應用Mann-Whitney U檢驗及Wilcoxon檢驗進行數據統計分析。結果：（1）NF-κB在4組中呈遞增性表達，EIN組與EC組間無顯著差異性（P＞0.05），與其余兩組組間表達均有統計學意義（P<0.05）。（2）eIF4E在EC中的表達明顯高于增殖期子宮內膜、子宮內膜增生及EIN，且EIN組與各組間差異有統計學意義（P<0.05）。（3）NF-κB和eIF4E在EIN及相關病變中的表達有顯著相關性（r=0.949，P＜0.05）。結論：NF-κB和eIF4E在EIN及EC中高表達，在EIN發展為EC的過程中逐漸被激活，進而加速轉錄、翻譯，增大EIN進展為子宮內膜樣癌的可能性。

子宮內膜上皮內瘤變；子宮內膜樣癌；NF-κB；eIF4E；免疫組化

子宮內膜癌在發達國家女性生殖系統惡性腫瘤中最常見，約占所有腫瘤的4%[1]。隨著我國經濟的發展、人們生活水平的不斷提高，我國子宮內膜癌的發病率也逐年上升。一直以來，子宮內膜癌病因學及發病機制始終是研究的重點和難點。2000年，該領域出現一重大突破，Mutter及其子宮內膜協作組提出子宮內膜上皮內瘤變(endometrial intraepithelial neoplasia,EIN)的概念[2]，將子宮內膜增生分為良性子宮內膜增生、EIN，并認為EIN是子宮內膜樣癌（endometrioid carcinoma,EC）癌前病變的組織形態學改變。關于EIN的相關研究報告己陸續見諸于國外文獻，但國內涉及EIN的研究報告卻很少。本研究采用免疫組化SP法分析了核轉錄因子-κB（NF-κB） 和真核細胞翻譯起始因子 4E (eukaryotictransla-tioninitiationfactor4E，eIF4E) 在EIN及其相關病變中的表達，探討NF-κB和eIF4E在EIN進展為子宮內膜樣癌過程中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫科大學總醫院病理科2013年1月-2014年12月刮宮標本85例，年齡29~80歲，平均年齡45.15歲。選取增殖期子宮內膜10例、子宮內膜增生30例（包括單純性增生15例、復雜性增生15例），子宮內膜樣癌20例，按照EIN診斷標準[3]篩選出EIN 25例。所有標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，厚度4 μm。

1.2 試劑 鼠抗人NF-κB（ZS-8008）（北京中杉金橋生物技術有限公司）、鼠抗eIF4E單克隆抗體（BM1738）（武漢博士德生物技術有限公司），免疫組化SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。

1.3 方法 組織標本（蠟塊）做4 μm厚連續切片，貼附于載玻片上，置于66～70℃烤箱中烤蠟1 h，經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯至水，PBS沖洗，3 min×2次，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置于微波爐內，中火，3 min×2次，自然冷卻至室溫，PBS沖洗，3 min×2次，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，3 min×2次，滴加一抗，置于濕盒中，4℃冰箱過夜，翌日，4℃冰箱取出，恢復至室溫，PBS沖洗，3 min×3次，滴加二抗工作液，37℃溫箱孵育40 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色系統顯色，統一時間滴加DAB工作液，顯微鏡下觀察，統一時間終止顯色，充分水洗、蘇木素復染細胞核、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4 結果判定 NF-κB及eIF4E陽性染色均位于細胞漿，呈棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機觀察10個高倍視野（×400），每個高倍視野計數100個細胞。先根據陽性細胞數所占的百分數計分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；再根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者評分相乘，0分為“－”；1～3分為“+”；4～6分為“2+”；7～12分為“3+”。

1.5 統計學分析 應用Mann－Whitney U檢驗及Wilcoxon檢驗進行分析，相關分析應用Spearman秩相關；采用SPSS l7.0統計軟件包進行數據分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 NF-κB、eIF4E在 EIN及其相關病變的表達 NF-κB及eIF4E陽性表達均定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒。NF-κB在子宮內膜樣癌組的陽性率達90%，明顯高于EIN組（80%）、子宮內膜增生組（53.33%）和增殖期子宮內膜組（30%），EIN組與子宮內膜樣癌組間差異無統計學意義（Z=－1.653，P= 0.098），與其余兩組組間差異顯著（P＜0.05）。eIF4E在增殖期子宮內膜、子宮內膜增生、EIN及子宮內膜樣癌中表達呈遞增趨勢，且EIN組與各組組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 NF-κB及eIF4E在EIN及其相關病變的表達(n)Tab 1 The expressions of NF-κB and eIF4E in EIN and associated lesions(n)

圖1 NF-κB、eIF4E在EIN和子宮內膜樣癌的表達(SP,×100)Fig 1 The expressions of NF-κB and eIF4E in EIN and endometrioid carcinoma(SP,×100)

2.2 NF-κB、eIF4E表達的相關性 Spearman相關分析顯示，NF-κB和eIF4E在EIN及相關病變中的表達呈顯著相關性（r=0.949，P＜0.05）。

3 討論

2000年Mutter提出的EIN一直是婦科病理學界關注的熱點。目前認為EIN是一種腫瘤性的單克隆增生，具有癌的一些遺傳學特征（如單克隆性，PTEN、K-ras和MLH等基因的改變)，被視為子宮內膜樣癌的癌前病變，但不具備癌的全部特征，其本質是上皮內腫瘤的形成，且不再分級[4]。EIN早期多為局灶性病變，進展后可形成彌漫性病變。本研究病例中，局灶性病變21例，彌漫性病變4例。

3.1 NF-κB、eIF4E在EIN和子宮內膜樣癌中的表達及意義 NF-κB是近年來發現的一種多向性、多功能的核轉錄因子，主要以具有活性的多肽p50/ p65異源性二聚體形式存在。當細胞受到胞外刺激時，NF-κB的內源性抑制因子IKB激活，介導p50/p65與κB位點結合，發揮調節細胞功能的作用，尤其是對腫瘤形成相關蛋白的調控，如Cyclin D1、CDK、c-myc、VCAM-1等[5]。NF-κB不僅調控免疫細胞的激活、細胞的發育，而且炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡、腫瘤形成及轉移等多種病理生理過程都有NF-κB的參與[6]。有研究表明，在胃癌、肺非小細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中，出現了NF-κB異常活化及高表達。NF-κB在實體腫瘤發生中有很中心的地位，在乳腺癌[7]中NF-κB轉錄激活加強乳腺癌癌前病變向癌的轉變，借助上調相應基因NOS、COX-2、VEGE來調節血管生成，促進乳腺癌遠處轉移。Jin[8]研究發現，NF-κB在胃癌中的激活能夠促進下游蛋白的表達，進而促進腫瘤的生長、侵襲，應用NF-κB抑制劑對減緩腫瘤進展有一定作用。但是，NF-κB在EIN或子宮內膜樣癌中的作用國內外報道很少。Surazynski[9]研究發現，子宮內膜樣癌組織中存在NF-κB的高表達，提示NF-κB激活后表達上調，進而影響子宮內膜癌的病情進展，依此推測子宮內膜癌的發生、發展極有可能與NF-κB激活有關。而Carlos等[10]研究卻顯示相反結果，在這項研究中，NF-κB在子宮內膜樣癌低表達，正常子宮內膜組織高表達，推測可能因為子宮內膜周期性剝脫涉及炎癥反應，NF-κB通過調控一些基因轉錄間接參與炎癥反應，因此正常子宮內膜呈現高水平。陳麗平[11]用免疫組化法檢測正常子宮內膜和子宮內膜癌中NF-κB的表達，結果顯示NF-κB在子宮內膜癌組織中高表達。本研究中，NF-κB在EIN中的表達高于增殖期子宮內膜和子宮內膜增生（Z=-2.129，P=0.033、Z=-1.998，P= 0.046）；低于子宮內膜樣癌，且EIN組與子宮內膜樣癌組間差異無統計學意義（P＞0.05），顯示出NF-κB在子宮內膜樣癌的癌前病變EIN及子宮內膜樣癌中的異常表達十分相近，提示NF-κB在EIN及子宮內膜樣癌的形成發展中具有相似的作用。NF-κB在增殖期子宮內膜中表達弱，推測NF-κB可能處于失活的有序調控中，隨著病變進展，NF-κB被激活，并不斷累積，進而在EIN及子宮內膜樣癌中高表達，充分體現NF-κB與腫瘤發生的密切相關性。

eIF4E定位于4q21~4q25染色體，是真核細胞翻譯起始因子eIFs家族的一員，在蛋白質合成起始階段起調控作用，并通過調控腫瘤相關mRNAs的翻譯參與腫瘤的發生發展[12]。有人提出，eIF4E表達受自身磷酸化、翻譯抑制蛋白家族活性(如4EBP1)及其基因轉錄(如ras、c-myc基因)等因素的調節，各種因素導致eIF4E過度表達，介導大量與腫瘤生長分化及浸潤轉移相關的蛋白質，如細胞周期素Cyclin D1、Rb蛋白、血管形成因子(FGF2、VEGF)、生存素survivin和Bcl-2等[13]。近年來研究顯示，eIF4E在多種腫瘤中有過度表達，如鼻咽癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌等，并與腫瘤的轉移、侵襲密切相關。Filippa等[14]研究報道eIF4E在乳腺原發腫瘤和轉移瘤中高表達，提示eIF4E能夠促進腫瘤的轉移，而低表達的eIF4E能夠降低乳腺腫瘤細胞的侵襲和遷移。eIF4E在EIN或子宮內膜樣癌中的作用國內外報道尚少。Darb-Esfahani等[15]通過m-TOR抑制劑雷帕霉素來抑制eIF4E的過度表達，發現子宮內膜癌細胞生長增殖明顯被抑。Choi等[16]研究發現eIF4E蛋白在子宮內膜腺癌中過度表達，Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，而正常內膜未發現過度表達，提示eIF4E蛋白過度表達與子宮內膜腺癌分期相關。國內有實驗發現，eIF4E在正常子宮內膜組織中低表達，與子宮內膜癌中的表達差異顯著[17]。本研究中eIF4E在增殖期子宮內膜、子宮內膜增生、EIN及子宮內膜樣癌中表達逐漸遞增，且EIN組與子宮內膜增生及子宮內膜樣癌組間均有顯著差異性（Z=-2.349，P=0.019；Z=-2.521，P=0.012）。提示eIF4E的過度表達參與了子宮內膜樣癌的發生發展過程，而在EIN的高表達，從分子水平上顯示EIN不同于普通子宮內膜增生，并在一定程度上提示EIN進展為子宮內膜樣癌的風險性加大。

3.2 NF-κB與eIF4E的相關性 子宮內膜癌的發生發展是一個多基因、多步驟的復雜過程，分子遺傳學研究證據表明，子宮內膜癌的發生可能是細胞調節通路相關基因（如原癌基因的激活，腫瘤抑制基因的失活）異常改變并逐步積累，引起細胞生長功能失調的結果[18]。有研究表明癌基因c-myc與子宮內膜癌的發生密切相關，而NF-κB作為細胞核轉錄的重要因子，可調控c-myc的表達和活性，同時eIF4E作為惡性蛋白質翻譯過程中關鍵因子，c-myc可與eIF4E啟動序列結合，激活eIF4E的轉錄翻譯。Hariri等[19]在研究中發現，在主要的造血干細胞系中，eIF4E水平可影響NF-κB活化，同時內源性eIF4E基因可以促進NF-κBp65和cRel定位在κB位點上，引起κB位點磷酸化進而導致NF-κB的活化，影響細胞轉錄水平。在本研究中，NF-κB與eIF4E的表達存在顯著相關性（r=0.949，P＜0.05），推測NF-κB與eIF4E在子宮內膜樣癌的發生發展中可能具有某種協同作用。

綜上，NF-κB與eIF4E在EIN及子宮內膜樣癌中高表達，表明EIN進展為子宮內膜樣癌的過程中細胞轉錄、翻譯加快，細胞增殖逐漸失控，推測NF-κB和eIF4E共同影響EIN發展為子宮內膜樣癌的進程，其中更深入的分子機制尚需進一步的研究。

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(2016-05-16收稿)

Expression and significance of NF-κB and eIF4E in endometrial intraepithelial neoplasia and endometrioid carcinoma

ZHAO Qing-qing，SONG Wen-jing
（Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Objective:To investigate the expressions and roles of NF-κB and eIF4E in the endometrial intraepithelial neoplasia(EIN)and endometrioid carcinoma(EC).Methods：Immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of NF-κB and eIF4E in the proliferative stage of endometrium,hyperplasia endometrium,EIN and EC.The statistical data were analyzed Using MannWhitney U test and Wilcoxon test.Results:(1)The expression levels of NF-κB increased gradually,and there was no statistically significant difference between EIN and EC(P＞0.05).However,difference between the EIN and other groups was significance.(2)The positive rate of eIF4E was significantly higher in EC than in proliferative stage of endometrium,hyperplasia endometrium and EIN(P<0.05).(3)NF-κB and eIF4E had a strong correlation between EIN and associated lesions(r=0.949,P＜0.05).Conclusion:NF-κB and eIF4E are highly expressed in EIN and EC.They may be gradually activated in the process of EIN development to EC,and then accelerate transcription or translation,and increase the possibility of endometrial carcinoma.

endometrial intraepithelial neoplasia;endometrioid carcinoma;NF-κB;eIF4E;immunohistochemistry

R737.33

A

1006-8147（2016）06-0483-04

趙慶慶（1990-），女，碩士在讀，研究方向：女性生殖系統腫瘤；通信作者：宋文靜，E-mail：songwenjing2004@aliyun.com。