肝臟缺血再灌注損傷中線粒體膜氧化應激和電生理功能障礙的分子機制研究

金濤，王興強，劉超

肝臟缺血再灌注損傷中線粒體膜氧化應激和電生理功能障礙的分子機制研究

金濤1，王興強2，劉超3△

目的探討肝臟缺血再灌注損傷中線粒體膜氧化應激和電生理功能障礙的分子機制。方法建立SD大鼠肝移植（冷缺血再灌注組，n=20）和肝臟肝門部分阻斷（熱缺血再灌注組，n=20）的缺血再灌注損傷模型。以大鼠僅作肝十二指腸韌帶分離，但不阻斷肝臟肝門血液供應的10只大鼠為假手術組，采集各組血標本測定丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-1β（IL-1β）水平；采集膽汁標本用于測定膽汁內葡萄糖的含量及γ-谷氨酰轉移酶（GGT）水平；采集肝組織標本用于測定丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD），流式細胞儀測定肝細胞線粒體膜電位，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測肝細胞內線粒體呼吸鏈復合體活性。結果冷、熱缺血再灌注組大鼠的ALT、AST、膽汁葡萄糖、GGT、TNF-α、IL-1β及MDA水平均高于假手術組（P＜0.01），且冷缺血再灌注組大鼠各項指標均高于熱缺血再灌注組（P＜0.05）。熱缺血再灌注組和冷缺血再灌注組大鼠肝臟SOD水平均明顯低于假手術組，并且熱缺血再灌注組的SOD水平高于冷缺血再灌注組（P＜0.01）。與假手術組相比，熱、冷缺血再灌注損傷組再灌注0 h（缺血1 h）、1 h、12 h線粒體膜電位細胞的比例均降低（P＜0.01）；熱、冷缺血再灌注損傷組組內隨時間延長其線粒體膜電位活性有逐漸恢復的趨勢（P＜0.01）。假手術組0、72 h的線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ、Ⅳ差異均無統計學意義；熱、冷缺血再灌注組72 h較0 h線粒體呼吸鏈復合體活性均增高（P＜0.01）；0、72 h時，假手術組，熱、冷缺血再灌注損傷組線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ呈依次降低，而線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ呈依次增高（P＜0.01）。結論缺血再灌注損傷的強應激刺激可導致肝細胞線粒體膜氧化應激，進而導致肝細胞受到損害，線粒體內相關酶系統活性受損，最終導致線粒體內呼吸鏈酶復合體活性受損傷，這可能是氧化應激導致肝細胞線粒體膜氧化應激和電生理功能障礙，繼而肝細胞損傷和能量代謝障礙發生的分子機制。

肝移植；再灌注損傷；疾病模型,動物；氧化應激；線粒體跨膜電位；肝臟損傷

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟疾病外科治療過程中常見的病理變化[1]。在肝臟移植手術、肝切除手術、肝臟血流阻斷手術等肝臟外科技術操作中不可避免地會造成肝臟的冷/熱缺血再灌注損傷。目前，有關肝臟缺血再灌注損傷的發病機制尚不完全清楚，但研究發現缺血再灌注過程所誘發的肝細胞能量代謝障礙與隨之發生的肝細胞壞死及凋亡有著密切的關聯[2]。因此，本研究選用大鼠冷/熱缺血再灌注損傷模型，探討肝臟缺血再灌注損傷中線粒體膜氧化應激和電生理功能障礙的分子機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型的建立和分組（1）大鼠肝移植冷缺血再灌注損傷模型（冷缺血再灌注組，冷缺血組）。成年、清潔級SD大鼠40只，體質量200～300 g，平均（265±18）g，雌雄不限，均分為供體組和受體組。所有大鼠術前12 h禁食、不限水。參照文獻［1］方法采取大鼠原位肝移植手術建立大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷動物模型，改良處為：術中將供體肝膽總管與受體大鼠膽總管套管相吻合并肝臟冷缺血時長為2 h；術后繼續燈照加溫復蘇；48 h內喂10%葡萄糖水，單籠喂養，其后正常進食。（2）大鼠肝臟肝門部分阻斷熱缺血再灌注損傷模型（熱缺血再灌注組，熱缺血組）和假手術組。成年、清潔級SD大鼠30只，體質量200～300 g，平均（260±19）g，雌雄不限。術前12 h禁食、不限水。取20只大鼠通過部分阻斷肝臟肝門來建立肝臟熱缺血再灌注損傷模型［1］，改良處為：熱缺血時長為30 min。另取10只為假手術組，大鼠開腹后找到并分離大鼠肝十二指腸韌帶，但不阻斷肝臟肝門血液供應；余步驟同熱缺血再灌注組。

1.2 標本采集及指標檢測方法模型大鼠造模成功后，每組大鼠分別在0 h（缺血1 h）、1 h、12 h、72 h活體取材。大鼠經乙醚麻醉滿意后，切開腹壁，選擇肝上、下腔靜脈穿刺取血，收集大鼠膽汁，并收取肝臟左、中葉肝組織待檢測，取材完畢后關腹，復蘇，其后正常進食。血標本經離心后，收集部分上清液體用于測定反映肝臟細胞功能指標的丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST），其余上清液體置于-70℃留存用于測定反映出肝臟膽管上皮細胞發生缺血再灌注損傷程度的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-1β（IL-1β）水平。膽汁標本用于測定膽汁葡萄糖的含量及γ-谷氨酰轉移酶（GGT）水平。選取部分肝組織標本研磨成10%的肝組織勻漿，測定間接反映膜系統受損程度的丙二醛（MDA）和體現機體清除活性氧能力的超氧化物歧化酶（SOD）水平；部分肝組織標本經0.9%生理鹽水洗凈后制備肝細胞懸液，利用熒光探針對肝細胞內線粒體行JC-1熒光染色，用流式細胞儀繪制反映JC-1熒光染色強度變化的流式圖，計算各組于再灌注0 h（缺血1 h）、1 h、12 h、72 h時線粒體膜電位下降細胞的比例。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別測定模型組于再灌注0 h（缺血1 h）、72 h經前述方法分離提純的肝細胞內線粒體呼吸鏈復合體活性的光密度（OD）值，并與標準曲線進行比較，計算模型組肝細胞中線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ、Ⅳ的濃度，并與假手術組結果相比較，以分析模型組線粒體功能。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，治療前后均數比較用配對t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟ALT、AST及膽汁葡萄糖等水平變化情況比較假手術組、熱缺血再灌注組、冷缺血再灌注組ALT、AST、膽汁葡萄糖、GGT、TNF-α及IL-1β水平均依次升高，組間多重比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠SOD和MDA水平變化情況的比較熱、冷缺血再灌注組大鼠肝臟SOD水平均低于假手術組。熱缺血再灌注組SOD水平高于冷缺血再灌注組；而熱、冷缺血再灌注組大鼠肝臟MDA水平均高于假手術組，并且熱缺血再灌注組的MDA水平低于冷缺血再灌注組（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠肝細胞線粒體膜電位變化情況與假手術組相比，熱、冷缺血再灌注損傷組再灌注0 h（缺血1 h）、1 h、12 h及72 h線粒體膜電位下降細胞的比例均降低（P＜0.05）；熱、冷缺血再灌注損傷組組內隨時間延長其線粒體膜電位活性有逐漸恢復的趨勢（P＜0.05），見表3。

Tab.1Comparison of the levels of ALT,AST and bile glucose in liver of rats between three groups表1 各組大鼠肝臟ALT、AST及膽汁葡萄糖等水平變化情況比較

Tab.1Comparison of the levels of ALT,AST and bile glucose in liver of rats between three groups表1 各組大鼠肝臟ALT、AST及膽汁葡萄糖等水平變化情況比較

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與熱缺血再灌注組比較，P＜0.05；表2～4同

組別假手術組熱缺血組冷缺血組F n 10 20 20 ALT（U/L）62.33±5.43 844.62±89.31a 1 458.54±179.57ab 407.630＊＊AST（U/L）61.47±6.11 883.48±99.37a 1 511.48±157.81ab 507.161＊＊膽汁葡萄糖(mmol/L) 1.24±0.21 2.83±0.88a 3.49±1.27ab 17.380＊＊組別假手術組熱缺血組冷缺血組F n 10 20 20 GGT(U/L) 24.47±4.62 53.21±8.34a 63.41±13.65ab 47.440＊＊TNF-α(μg/L) 0.74±0.21 1.83±0.41a 2.39±0.47ab 54.770＊＊IL-1β(μg/L) 0.17±0.07 0.81±0.18a 1.31±0.25ab 112.420＊＊

Tab.2Comparison of SOD and MDA levels between three groups表2 各組SOD和MDA水平比較

Tab.2Comparison of SOD and MDA levels between three groups表2 各組SOD和MDA水平比較

組別假手術組熱缺血組冷缺血組F n 10 20 20 SOD（U/mg）24.79±4.23 11.22±3.25a 6.89±2.52ab 105.630＊＊MDA(μmol/g) 3.67±1.09 15.36±4.11a 21.62±4.22ab 75.371＊＊

2.4 各組大鼠線粒體呼吸鏈復合體活性變化情況比較組內比較：假手術組0、72 h的線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ、Ⅳ差異均無統計學意義；熱、冷缺血再灌注組72 h較0 h線粒體呼吸鏈復合體活性均增高（P＜0.01）。組間比較：0、72 h時，假手術組，熱、冷缺血再灌注損傷組線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ呈依次降低，而線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ呈依次增高，組間多重比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

Tab.3Comparison of mitochondrial membrane potential at different time points before and after treatment between three groups表3 各組治療前后不同時間段線粒體膜電位比較

Tab.3Comparison of mitochondrial membrane potential at different time points before and after treatment between three groups表3 各組治療前后不同時間段線粒體膜電位比較

組別假手術組熱缺血組冷缺血組F n F 10 20 20 0 h 0.29±0.07 0.16±0.08a 0.12±0.05ab 21.600＊＊1 h 0.28±0.09 0.18±0.08a 0.16±0.06ab 9.010＊＊12 h 0.30±0.08 0.21±0.09a 0.18±0.06ab 8.165＊＊72 h 0.28±0.09 0.26±0.08 0.24±0.06 1.000 0.130 5.542＊＊15.042＊＊

Tab.4Comparison of the activities of respiratory chain complexes in different time points between three groups表4 各組不同時間段線粒體呼吸鏈復合體活性比較[μmol/（min·mg），]

Tab.4Comparison of the activities of respiratory chain complexes in different time points between three groups表4 各組不同時間段線粒體呼吸鏈復合體活性比較[μmol/（min·mg），]

組別假手術組熱缺血組冷缺血組F n 線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ0 h 64.25±5.88 50.21±4.63a 42.37±4.22ab 71.050＊＊72 h 63.74±5.92 59.36±5.12a 51.08±4.85ab 23.612＊＊t t 10 20 20 0.193 5.928＊＊6.059＊＊線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ0 h 17.29±2.13 18.34±2.28a 22.65±3.31ab 18.080＊＊72 h 17.31±2.11 22.46±2.89a 27.79±3.27ab 45.240＊＊0.021 5.005＊＊4.940＊＊

3 討論

缺血再灌注損傷是肝臟外科疾病中常見的病理進程。進行肝臟切除的過程中需要對肝臟血液流入通道以及血液流出通道進行阻斷，或進行選擇性半肝血流阻斷等多種外科措施來減少或避免術中出血、保證手術的順利進行，但對肝臟血流進行阻斷與恢復最終必然會導致肝臟發生熱缺血再灌注損傷［3］。同時，隨著肝臟移植手術逐漸成為各種終末期肝臟疾病的最佳治療方式，供體肝臟在術前均需要進行冷灌注和保存，這勢必又導致肝臟冷缺血再灌注損傷的增加。研究認為，肝臟的冷、熱缺血再灌注損傷是導致患者在手術后發生肝臟功能減退、肝臟淤血甚至移植物無功能等嚴重并發癥的重要原因［4］。

目前，有關肝細胞發生損傷的機制尚未完全明確，但近年來研究表明在缺血再灌注初期由于循環障礙，易造成血管內皮細胞腫脹，進而可造成血管管腔狹窄，血液中體積較大的白細胞發生嵌頓，誘發血小板凝聚，形成局部微循環損害，又造成局部組織缺乏能量供應，致細胞毒性水腫，最終進一步加劇血管內皮細胞以及枯否細胞的腫脹和血管收縮［5］。缺血再灌注損傷后，隨著局部缺血時間的延長，可引發枯否細胞、中性粒細胞的活化，釋放炎性因子及氧自由基，通過一系列氧化應激過程最終導致肝細胞損傷加劇［6］。因此，肝細胞能量狀態是肝細胞發生缺血再灌注損傷關鍵因素。

在生理狀態下，機體內不斷生成氧自由基，同時又不斷將氧自由基清除以保持動態平衡。肝臟發生缺血再灌注損傷致使肝細胞出現缺血缺氧，促使ATP分解代謝加劇，其代謝產物次黃嘌呤在肝細胞內大量積聚。氧化應激過程加劇，可致機體內源性抗氧化劑消耗殆盡，最終導致細胞產生大量的氧自由基［7］。此外，激活的肝巨噬細胞、中性粒細胞、單核吞噬細胞等在缺氧狀態下細胞膜的煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶受到刺激，這進一步加劇了氧自由基的聚集。氧自由基的另一個重要來源是線粒體，肝細胞缺血再灌注損傷過程可導致線粒體膜電位喪失，進而導致呼吸鏈功能障礙［8］。血清ALT和AST是反映肝臟細胞功能最常用的指標。大鼠膽汁葡萄糖GGT水平能夠反映出肝臟膽管上皮細胞發生缺血再灌注損傷的程度［9］。本研究結果顯示，熱、冷缺血再灌注組大鼠ALT、AST及膽汁葡萄糖等水平均明顯高于假手術組，表明在缺血再灌注過程中，大鼠肝細胞及膽管上皮細胞均存在明顯的損傷。TNF-α和IL-1β是在肝細胞發生缺血再灌注損傷過程中發揮主要作用的兩個細胞因子。SOD能夠拮抗缺血再灌注損傷所導致的氧化應激過程，保護肝細胞免于受到氧自由基的攻擊，且SOD活性的高低間接體現了機體清除活性氧的能力。本研究結果顯示，與假手術組相比，冷、熱缺血再灌注損傷組TNF-α和IL-1β升高，SOD和再灌注0 h（即缺血1 h）、1 h、12 h、72 h線粒體膜電位下降細胞的比例均降低；冷、熱缺血再灌注損傷組組內隨時間延長其線粒體膜電位活性有逐漸恢復的趨勢，提示缺血再灌注后TNF-α和IL-1β均參與了肝細胞損傷的過程，但損傷發生后肝臟迅速開啟了自我修復過程。

肝臟細胞缺血再灌注損傷發生后最終會造成肝臟細胞的死亡。肝細胞死亡方式主要包括肝細胞凋亡、肝細胞膨脹性壞死以及肝細胞自噬性死亡［10］。這些死亡方式往往是同時交錯存在于肝臟缺血再灌注損傷中。肝細胞膨脹性壞死往往是由于肝臟細胞能量耗盡，從而導致細胞發生崩解，細胞出現水腫、胞內出現空泡、細胞核溶解碎裂，這種死亡過程不可逆。線粒體內含有眾多與凋亡發生有關的促凋亡蛋白，細胞色素C是其中最具代表性的分子，從線粒體中釋放出的細胞色素C有誘導細胞凋亡的作用，在胞漿內與凋亡酶激活因子連接，并與脫氧腺苷三磷酸（dATP）合二為一，形成一寡聚凋亡體［11］。該凋亡體通過對細胞凋亡蛋白酶9-前原蛋白進行結合或裂解，以體現其成熟的活化性。激活的凋亡蛋白酶9刺激后續凋亡蛋白酶，以控導細胞凋亡。本研究結果顯示，與假手術組相比，冷、熱缺血再灌注損傷組再灌注0 h（缺血1 h）、72 h線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ、Ⅳ活性差異有統計學意義；且相同時間點熱缺血再灌注組的呼吸鏈復合體Ⅲ活性高于冷缺血再灌注組，線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性低于冷缺血再灌注組，而72 h較0 h活性均增高，表明冷、熱缺血再灌注損傷組組內隨時間延長其線粒體呼吸鏈復合體活性有逐漸恢復的可能。

綜上所述，缺血再灌注損傷的強應激刺激可導致肝細胞線粒體膜氧化應激，線粒體內相關酶系統活性受損，最終損傷線粒體內呼吸鏈酶復合體活性，這可能是肝細胞缺血再灌注損傷發生的分子機制。

[1]CettaF，FusaiG，MalagòM.LiverPathophysiology：Liver Regeneration，Vascular alterations，and Ischemia/Reperfusion［M］. In:Luca Aldrighetti,Francesco Cetta,Gianfranco Ferla ed.Benign Tumors of the Liver.Switzerland:Springer International Publishing，2015：35-45.doi:10.1007/978-3-319-12985-3_4.

[2]Nace GW，Huang H，Klune JR，et al.Cellular-specific role of tolllike receptor 4 in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice［J］. Hepatology，2013，58（1）：374-387.doi:10.1002/hep.26346．

[3]Yang M，Antoine DJ，Weemhoff JL，et al.Biomarkers distinguish apoptoticandnecroticcelldeathduringhepaticischemia/ reperfusion injury in mice［J］.Liver Transpl，2014，20（11）：1372-1382.doi:10.1002/lt.23958.

[4]Attila S.Free radicals and hepatic ischemia-reperfusion［J］.Orv Hetil，2015，156（47）：1904-1907.

[5]Suyavaran A，Ramamurthy C，Mareeswaran R，et al.TNF-α suppression by glutathione preconditioning attenuates hepatic ischemia reperfusion injury in young and aged rats［J］.Inflamm Res，2015，64（1）：71-81.doi:10.1007/s00011-014-0785-6.

[6]Joe Y，Zheng M，Kim HJ，et al.Cilostazol attenuates murine hepatic ischemia and reperfusion injury via heme oxygenase-dependent activationofmitochondrialbiogenesis［J］.AmJPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2015，309（1）：G21-G29.doi:10.1152/ ajpgi.00307.2014.

[7]Chouchani ET，Pell VR，James AM，et al.A unifying mechanism for mitochondrial superoxide production during ischemia-reperfusion injury［J］.Cell metabolism，2016，23（2）:254-263.doi:10.1016/j. cmet2015.12.009.

[8]Brandlhuber M，Armbruster M，Zupanc B，et al.A Novel and SensitiveApproachfortheEvaluationofLiverIschemia-Reperfusion Injury After Liver Transplantation［J］.Invest Radiol，2016，51（3）：170-176.doi:10.1097/RLI.0000000000000220.

[9]Yeh DY，Yang YC，Wang JJ.Hepatic warm ischemia-reperfusion–induced increase in pulmonary capillary filtration is ameliorated by administration of a multidrug resistance-associated protein 1 inhibitor and leukotriene D4 antagonist(MK-571)through reducing neutrophil infiltration and pulmonary inflammation and oxidative stress in rats［J］.Transplant Proc，2015，47（4）：1087-1091.doi: 10.1016/j.transproceed.2014.10.061.

[10]Gracia-Sancho J，Casillas-Ramírez A，Peralta C.Molecular pathways in protecting the liver from ischaemia reperfusion injury: a 2015 update［J］.Clin Sci(Lond)，2015，129（4）：345-362.doi: 10.1042/CS20150223.

[11]Hu Q，Wood CR，Cimen S，et al.Mitochondrial damage-associated molecular patterns(MTDs)are released during hepatic ischemia reperfusion and induce inflammatory responses［J］.PLoS One，2015，10（10）：e0140105.doi:10.1371/journal.pone.0140105.

（2016-06-03收稿2016-07-29修回）

（本文編輯陸榮展）

The pathogenesis of oxidative stress damage to mitochondrial membrane and electrophysiological dysfunction of ischemia reperfusion injury of hepatocytes in rats

JIN Tao1,WANG Xingqiang2,LIU Chao3△
1 Department of ICU,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin 300100,China;2 Department of ICU,Tianjin 1st Central Hospital; 3 Department of Cardiology,Tianjin Chest Hospital△

ObjectiveTo explore the pathogenesis of oxidative stress damage to mitochondrial membrane and electrophysiological dysfunction of ischemia reperfusion injury of hepatocytes in rats.MethodsSeventy rats were randomly divided into three experimental groups:sham operation(SHAM)group,warm hepatic ischemia/reperfusion(wI/R)group and cold hepatic ischemia/reperfusion(cI/R)group.Blood samples were collected for the detection of alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase(AST),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin(IL)-1 β levels.Bile samples were collected for the detection of glucose and γ-glutamyl transferase(GGT)levels.And liver samples were collected for the detection of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD).Flow cytometry was used to detect mitochondrial membrane potential.The mitochondrial respiratory chain complex was examined using ELISA to assess ischemia reperfusion injury of hepatocytes in rats.ResultsThe results indicated that ALT,AST,GLU,GGT,TNF-α,IL-1β and MDA levels were increased significantly in the wI/R group and cI/R group than those in SHAM group(P＜0.01),and those indexes were significantly higher in cI/R group than those of wI/R group(P＜0.05).The SOD level was significantly lower in wI/R group and cI/R group than that in SHAM group,which was significantly higher in wI/R group than that of cI/R group(P＜0.01).Compared with SHAM group,ratios of mitochondrial membrane potential were significantly decreased at 0,1 and 12 h I/R in wI/R group and cI/R group(P＜0.01).The activity of mitochondrial membrane potential was gradually recovered with time in wI/R group and cI/R group(P＜0.01).There were no significant differences in mitochondrial respiratory chain complexesⅢandⅣbetween 0 h and 72 h in SHAM group.The activity of mitochondrial respiratory chain complexes was increased at 72 h than that of 0 h in wI/R group and cI/R group(P＜0.01).The activity of mitochondrial respiratory chain complexesⅢwas decreased ordinally at 0 h and 72 h,and the activity of mitochondrial respiratory chain complexesⅣwas increased ordinally in SHAM group,wI/R group and cI/R group(P＜0.01).ConclusionMitochondrial membrane potential is significantly decreased after ischemia reperfusion injury,and the activity of mitochondrial respiratory chain complexes is significantly decreased as well,which might be the pathogenesis of oxidative stress damage to mitochondrial membrane and electrophysiological dysfunction of ischemia reperfusion injury of hepatocytes in rats.

liver transplantation；reperfusion injury；disease models,animal；oxidative stress；mitochondrial transmembrane potential；liver damage

R657.3，R364.12

A

10.11958/20160500

2013年中國博士后科學基金資助項目（2013M530880）；2015年中國博士后科學基金資助項目（2015M581308）

1天津市南開醫院重癥醫學科（郵編300100）；2天津市第一中心醫院移植ICU；3天津市胸科醫院心內科

金濤（1973），男，副主任醫師，學士，主要從事危重癥醫學方面研究

△通訊作者E-mail：liuchao74001@126.com