酶法檢測糖化白蛋白的性能驗證及其在2型糖尿病患者中的臨床應用價值

曹輝彩，趙家慧，陳妹紅，靳麗亞，王之秀，陳翼霖

(1.河北省保定市第一中心醫院東院檢驗科, 河北 保定 071000；2.河北大學醫學院2014級臨床3班，河北 保定 071000；3.河北省保定市第一中心醫院總院心電圖室，河北 保定 071000)

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·論 著·

酶法檢測糖化白蛋白的性能驗證及其在2型糖尿病患者中的臨床應用價值

曹輝彩1，趙家慧2，陳妹紅3*，靳麗亞1，王之秀1，陳翼霖1

(1.河北省保定市第一中心醫院東院檢驗科, 河北 保定 071000；2.河北大學醫學院2014級臨床3班，河北 保定 071000；3.河北省保定市第一中心醫院總院心電圖室，河北 保定 071000)

目的對寧波瑞源公司酶法檢測糖化白蛋白(glycated albumin，GA)定量進行性能驗證并評價其臨床應用價值。方法收集標本檢測酶法測定GA的精密度、準確度、線性范圍評價、試劑空白吸光度、參考區間驗證，驗證其在2型糖尿病患者中的臨床性能。結果 低、中和高3個濃度GA 樣品的批內精密度分別為1.45%、1.08%、1.06%,批間精密度分別為1.68%、1.13%、1.19%,相對偏倚為1.54%,在參考物質允許的偏倚范圍內,準確度符合相關文件的要求。GA線性分析方程式為Y=0.998X +1.170,r=1.000,表明GA在129～925 μmol/L范圍內白蛋白與鈷結合線性良好。試劑空白吸光度是反映試劑質量的指標之一,本實驗測得空白吸光度平均值為0.004 2，顯示該試劑對檢測結果的干擾非常小。20例無感染的健康體檢者中19例在正常參考區間范圍內。證明說明書推薦的參考區間適合本實驗室檢測人群。血清GA對于診斷糖尿病的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%。GA可用于糖尿病的診斷和療效評估。結論酶法檢測GA的性能指標均符合實驗室質量的要求，適用于臨床樣本的檢測及糖尿病患者的療效評估。

糖尿病，2型；白蛋白類；實驗室能力驗證

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。DM患者的血糖如果長期升高,會導致眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害和功能障礙。據臨床數據表明,將有30%～40% DM患者發病10年后至少發生一種并發癥,且并發癥一旦產生，藥物治療很難逆轉，因此強調盡早預防DM并發癥發生。血糖監測在DM患者治療過程中起著非常重要的作用,控制好血糖能及時延緩DM患者并發癥的發生及發展,短期平均血糖控制是血糖長期達標非常重要的手段。DM的短期監控指標有血糖、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、糖化白蛋白(glycosylated albumin,GA)等。HbA1c可以反映近2～3個月的血糖控制水平，而人體中的葡萄糖與血清蛋白的N-末端發生非酶促糖基化反應，其中 90% 以上為 GA，GA 可以反映近2～3周血糖控制的平均水平，可評價短期內血糖變化，具有較高的臨床應用價值[1]。本研究采用酶法測定GA的各項性能指標,驗證其是否符合實驗室質量要求,同時對其在2型DM患者中的臨床應用價值進行評價，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣品來源

1.1.1 用于臨床性能驗證的樣品 選取2015年5—12月我院內分泌科收治的明確診斷為DM的患者156例作為病例組，男性97例，女性59例，年齡14～95歲，平均(60.4±19.1)歲。同時選取2015年11—12月在我院參加體檢的血糖正常健康體檢者216例作為對照組，男性112例，女性104例，年齡20～84歲，平均(51.0±17.1)歲。

1.1.2 用于性能驗證的樣本 ①低值標本：選擇本院內分泌科患者血清，其濃度盡可能接近可報告范圍低限。②高值標本：選擇本院內分泌科患者的血清，其濃度盡可能接近可報告范圍高限。③中值血清：將上述低值血清與高值血清按1∶1的比例混合。

1.2 試劑和儀器 GA試劑、校準品、質控品均由寧波瑞源生物科技有限公司提供，批號分別為2015052301、20150602、20150602。血清白蛋白檢測校準品(批號:901UN) 由英國朗道提供。檢測儀器為日立7600全自動生化分析儀。

1.3 驗證方法 依照美國臨床和實驗室標準化協會評價方案驗證，每天測定低值和高值2個水平的指控,室內質控在控后進行標本檢測。

1.3.1 精密度的驗證 精密度包括批內和批間精密度,精密度的程度常用標準差和變異系數來表示。按照臨床與實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)頒布的EP5-A2文件評價。批內精密度：將3個濃度的樣本隨患者標本同時檢測,連續檢測20次；計算其均值、標準差和變異系數；以批內變異系數小于1/4允許總誤差為結果可接受。批間精密度：每天測定1次3個濃度的評價樣本，共檢測20 d，累計20次,計算其均值、標準差和變異系數；以批間變異系數小于1/3允許總誤差為結果可接受。

1.3.2 準確度驗證 準確度指測得值與真值之間相符合程度,它的高低常以誤差的大小衡量。本實驗通過檢測已知濃度的校準品,計算相對偏倚。相對偏倚=(靶值-測定值)/靶值×100%, 若相對偏倚在允許的偏倚范圍內結果為可接受[2]。

1.3.3 線性范圍驗證 線性范圍是指試劑盒按說明書使用可準確測量的范圍,是衡量其質量的重要指標。參照CLSI EP6文件,選取一份高濃度樣本(H)和份低濃度樣本(L),其結果盡可能接近廠家提供的檢測上限和下限,分別按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H體積比混合成6個不同濃度的樣本,每個濃度重復檢測3次,計算其均值。將實測值(Y)和理論值(X)進行比較,計算Y=bX+a驗證線性范圍。 要求r≥0.975,a值在1±0.05范圍內，截距b小于檢測上限的5%。

1.3.4 試劑空白吸光度驗證 試劑空白是指由于測試試劑本身給檢測結果帶來的誤差。其檢測方法是按照正常的檢測方法，把樣本換成去離子水。

1.3.5 參考區間驗證 參考區間在我國通常又稱為“參考范圍”、“正常范圍”、“正常值”等,是指從參考下限到參考上限的區間。通常是中間95%區間,參照CLSI C28-A2文件,從本地參考人群中募集參考個體20例采樣并測定,測定值剔除離群值后若不滿20例需補足。將這20個測定值與需驗證的參考區間比較,若落在參考限外的測定值不超過2個，則該參考區間可直接使用,若大于2個及以上檢測結果超出,重新篩選20例,重復上述操作。若仍然有3個或3個以上測定值超出,則實驗室應重新檢查所用的分析程序,考慮是否有人群差異,考慮是否需要自己建立參考區間。

1.3.6 臨床性能驗證 臨床檢驗結果的最終目是用于患者的臨床治療,因此檢測方法的評價應包括臨床性能驗證[3],這種性能驗證能力可用靈敏度和特異度來衡量[4]。靈敏度指由金標準確診有病的實驗組內所檢測出陽性病例數的比率(%)，即本實驗診斷的真陽性率。靈敏度=[真陽性/(真陽性+假陰性)]×100%；特異度=[真陰性/(假陽性+真陰性)]×100%。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計算均值、精密度、相對偏倚、參考區間、靈敏度和特異度，進行線性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 精密度結果分析 低、中、高3個濃度的批內精密度和批間精密度均低于CLIA′88分析質量要求規定的1/3允許總誤差, 結果均可接受。見表1。

表1 GA精密度結果

2.2 準確度結果分析 檢測與當前檢測系統校準的校準品應為不同批號配套校準品,重復檢測3次,結果分別為487.132 μmol/L、488.321 μmol/L、486.741 μmol/L，其平均值為487.400 μmol/L,理論值為480 μmol/L,相對偏倚為1.54%,低于CLIA′88分析質量要求規定的1/3允許總誤差(5%),結果可接受。

2.3 線性范圍評價 選擇GA低值標本(L)和高值標本(H)各1份，濃度分別為129 μmol/L、925 μmol/L。將6個不同濃度的標本分別編號1、2、3、4、5、6。以實測均值Y為縱坐標,理論值X為橫坐標做圖并計算其回歸方程Y=bX+a,并做散點圖進行線性回歸分析。經分析GA線性分析方程式為Y=0.998X+1.170,r=1.000，P<0.001。表明GA在129～925 μmol/L范圍內白蛋白與鈷結合線性良好,結果見表2及圖1。

表2 GA線性范圍評價結果 (μmol/L)

圖1 GA線性分析

Y=0.998X+1.170,r=1.000，P<0.001

2.4 試劑空白吸光度 GA的試劑空白吸光度平均值為0.042。

2.5 參考區間驗證 參考CLSI C28-A2的要求,將疑似離群點和相鄰點的差值(D)與數據全距(R)相除。若D/R≤1/3，即可排除離群點,若>1/3考慮為離群值,將其剔除。本實驗D/R≤1/3無離群值。20份檢測結果19例在試劑生產廠商提供的11%～16%參考范圍內。初步證明說明書推薦的參考區間適合本實驗室檢測人群。見表3。

表3 GA參考區間驗證結果

2.6 臨床性能驗證 檢測病例組和對照組GA水平,以GA>16%判定為陽性。血清GA對于DM患者的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%，見表4。

表4 GA的臨床性能驗證 (例數)

3 討 論

近年來,DM已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后第3位嚴重危害人類健康的慢性疾病[5-7]。DM患者血糖控制不良可導致DM腎病、心血管疾病等多種并發癥,GA與DM大血管、微血管并發癥的關系也尤為密切[8]。最新DM流行病學顯示目前全球將近4億DM患者中約1/3存在視網膜病變或不同程度的DM相關眼損傷[9]。另有研究表明GA可以應用于妊娠期DM的篩查[10]。血糖的良好控制可以延緩DM腎病進展、減輕體內臟器損傷、有效降低心血意外事件的發生及尿毒癥透析患者的病死率[11]。檢測GA水平也可用于監控孕婦孕期血糖水平以及老年無癥狀性或夜間低血糖診斷。目前GA已作為血糖監測首選指標。GA半衰期較短，測定GA的濃度可有效反映患者過去2～3周內平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響[12]。由于GA的衰期比HbA1c短，故GA反映血糖變化比HbA1c敏感。GA在治療效果的確認以及臨床用藥量的調整方面比HbA1c更有優勢。而且在許多血紅蛋白代謝異常的情況下HbA1c水平受到影響不能真實反映患者的血糖水平,而GA的結果不受影響,如DM腎病透析患者、貧血患者、妊娠期婦女的血糖檢測等。因此，GA能更及時、更確切地反映較短期內DM的控制程度。

本研究GA檢測采用的是酶法,其原理是樣品中GA在被特異性的蛋白酶裂解釋放出糖化氨基酸,經糖化氨基酸氧化酶氧化后產生過氧化氫,過氧化氫經Trinder系統顯色后觀其顏色深淺與糖化血清蛋白含量成正比,與標準比較后可求得GA的含量。實驗室在使用新的檢測方法或儀器設備時,應對其性能進行初步評估[13]。本研究參照CLSI系列文件對寧波瑞源生物科技有限公司的GA檢測試劑盒和日立7600全自動生化分析儀組成的檢測系統進行了性能評價和臨床性能驗證。結果顯示該試劑盒低、中、高3個濃度的批內精密度分別為1.45%、1.08%、1.06%,批間精密度分別為1.68%、1.13%、1.19%，均符合廠商說明書要求小于5%,保證了檢測結果的穩定性和重復性。準確度用來表示系統誤差的大小,本研究參考相關文獻進行了準確度的評價,結果符合相關文件的要求。本研究試劑空白吸光度平均為0.042,提示本試劑對檢測結果的干擾非常小。參照CLSI EP6文件的要求對酶法測定GA進行了線性范圍評價,GA線性分析方程為Y=0.998X-1.170,r=1.000,表明GA在129～925 μmol/L范圍內白蛋白與鈷結合線性良好。實驗室在使用試劑生產廠商提供的參考區間之前,應按C28-A2文件進行參考區間的驗證[14],本研究采用20份體檢合格的健康成人樣本來驗證廠家提供的參考區間，20份檢測結果19例在試劑生產廠商提供的11%～16%參考范圍內，初步證明說明書推薦的參考區間適合本實驗室檢測人群。血清GA對于診斷DM的靈敏度、特異度分別為90.4%、95.8%，能為醫生對DM的早期診斷及控制情況提供準確的診斷依據,從而改善患者預后和減少并發癥。

綜上所述,GA檢測可準確地反映DM患者短期平均血糖的水平及變化,具有非常重要的臨床價值。其檢測方法簡便、準確和實用。GA與諸多DM慢性并發癥如慢性腎病、心血管病變有關。因此，通過GA檢測監測DM早期病變，盡早發現和控制DM并發癥，是非常有價值的研究方向。

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(本文編輯：趙麗潔)

2016-03-17；

2016-09-09

曹輝彩(1975-)，女，河北趙縣人，河北省保定市第一中心醫院主任檢驗師，醫學碩士，從事臨床檢驗學研究。

*通訊作者。E-mail:chc1718@163.com

R587.1

B

1007-3205(2016)11-1350-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.029