茶尺蠖為害提高鄰近茶苗對茶尺蠖幼蟲的防御能力

雷舒，李喜旺，孫曉玲，王志英，辛肇軍*

1. 東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶尺蠖為害提高鄰近茶苗對茶尺蠖幼蟲的防御能力

雷舒1,2，李喜旺2,3，孫曉玲2,3，王志英1*，辛肇軍2,3*

1. 東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

本文研究了茶樹蟲害誘導揮發物（Herbivore-induced plant volatiles, HIPVs）對鄰近茶苗防御能力的影響。將健康茶苗放在茶尺蠖取食的茶苗附近，作為HIPVs的處理，測定了茶樹防御相關基因在不同處理下的表達水平、抗性防御物質的水平，并檢測了茶尺蠖危害茶苗鄰近植株對茶尺蠖幼蟲生長的影響。研究結果表明，與對照相比，茶尺蠖幼蟲為害茶苗釋放的HIPVs在處理后24 h和12 h內分別顯著誘導鄰近茶苗CsiLOX1和CsiACS1基因的表達水平，這些揮發物還能增強茶尺蠖取食誘導的防御基因的表達。HIPVs處理3 d后，茶樹的重要防御物質多酚氧化酶（Polyphenol oxidases, PPOs）活性顯著高于對照，是對照的1.36倍，同時，取食這些茶苗的茶尺蠖幼蟲體重也顯著低于對照。上述結論表明茶尺蠖取食誘導的揮發物能夠作為信號物質在茶樹中傳遞，并能夠通過增強茉莉酸和乙烯抗蟲途徑提高對茶尺蠖的抗性。

茶樹；茶尺蠖；臨近茶樹；誘導防御反應

植物在與植食性昆蟲的長期協同進化過程中，獲得了多種誘導防御反應來抵御其為害[1-2]。在識別植食性昆蟲激發子（Elicitor）的基礎上，植物通過激活體內多種信號轉導途徑（如茉莉酸、水楊酸、乙烯等），繼而誘導防御相關基因表達水平的上升、防御化合物的積累以及蟲害誘導揮發物（Herbivore-induced plant volatiles，HIPVs）的大量釋放，從而對植食性昆蟲產生直接或間接防御反應[3-4]。為增強自身的生存競爭能力，植物還能通過個體內或個體間的化學信號交流對即將到來的為害進行防御準備[3,5-6]。其中，HIPVs作為重要化學信號可以在個體間傳遞的現象已在利馬豆Phaseolus lunatus L.、煙草Nicotiana attenuate L.、番茄Lycopersicon esculentum Mill.、榿木Alnusglutinosa等多種植物中得到證實[7-10]。大量研究結果揭示HIPVs能夠誘導鄰近的同種或異種植物產生防御反應以增加個體的適應性[3,11-12]。例如，靠近損傷植株后，健康糖槭Acer saccharum體內的酚類物質和單寧的濃度都顯著提高[7]。

茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）是茶園中發生普遍且危害嚴重的食葉性害蟲種類之一，年發生6～7代，嚴重發生時可將茶樹吃成光桿甚至直接導致茶樹死亡。茶尺蠖幼蟲的取食為害，可以提高茶樹葉片茉莉酸和乙烯信號分子含量，以及脂氧合酶基因（CsiLOX1）、乙烯合成酶基因（CsiACS1）等多種防御基因的轉錄水平[13-14]；同時還能誘導茶樹釋放大量的揮發性有機化合物，顯著影響茶尺蠖成蟲和其幼蟲寄生蜂——單白綿絨繭蜂Apanteles sp.的寄主選擇行為[15-17]；而茶尺蠖幼蟲取食處理和機械損傷加其反吐物處理卻會抑制茶樹葉片中重要防御化合物多酚氧化酶（PPOs）的活性[18]。然而，茶尺蠖幼蟲為害誘導茶樹釋放的揮發物能否作為化學信號在茶樹間傳遞，以及它們能否誘導鄰近茶樹的防御變化等問題仍不得而知。鑒于此，本研究通過檢測健康茶苗與茶尺蠖幼蟲為害苗的鄰近植株茶樹葉片中CsiLOX1和CsiACS1轉錄水平的表達量，以及比較不同處理植株PPOs活性及茶尺蠖幼蟲的生長發育速率，確定茶尺蠖幼蟲為害誘導茶樹釋放的揮發物對鄰近植物防御水平的影響，以期為從蟲害誘導茶樹揮發物中篩選可誘導茶樹防御的化學激發子提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1供試茶苗

供試茶苗為龍井43，2年生扦插苗，于(26±2)℃溫室中培養，光照12L∶12D，相對濕度60%～70%，每4個月施1次有機肥。選擇長勢良好、無病蟲害茶苗用于試驗。

1.2供試茶尺蠖

茶尺蠖幼蟲采自御茶村茶業有限公司所屬茶園（浙江，紹興）。室內飼養于RXZ智能型人工氣候箱內，溫度(25±2)℃，相對濕度60%～80%，光照周期為14L∶10D，飼以新鮮茶樹葉片。室內飼養1代后，第2代茶尺蠖初孵幼蟲用于生物測定，3齡幼蟲用于茶苗處理。

1.3茶苗處理

試驗在(25±2)℃，相對濕度60%～80%，光照條件為16L∶8D的條件下進行。茶苗隔天澆一次水，在75cm×75cm×150cm的密閉容器中進行處理（圖1），容器中間以滅菌透氣紗布隔開。蟲害苗為50頭3齡茶尺蠖幼蟲（TG）取食的茶苗，50%茶尺蠖取食后記錄處理時間。在每組實驗中，5株蟲害苗或健康苗分別與5株健康苗（受體植物）同時放置于容器兩端。與健康苗同時放置的受體植物稱為Receiver-C（簡稱對照C），與蟲害苗同時放置的受體植物稱為Receiver-T（簡稱處理T）。第1組茶苗于處理0、12、24、48、72 h后分別取對照C和處理T的芽下第2葉，用于靶標基因轉錄水平檢測；第2組茶苗于處理72 h后取芽下第2葉用于PPO活性檢測；第3組茶苗于處理3 d后從裝置中取出，利用1頭茶尺蠖（3齡）取食對照C（TG）或處理T第2葉位6 h（雙處理），樣品用于靶標基因轉錄水平檢測。每組處理5個重復。

圖1　茶尺蠖幼蟲危害誘導臨近茶苗防御反應處理裝置圖Fig. 1 Setup of container used for treatment

表1　用于qRT-PCR的引物分布情況Table 1 Description of the primers used for qRT-PCR

1.4基因表達量分析

取0.10g樣品，采用試劑盒（TIANGEN，天根生化科技有限公司，北京）進行總RNA提取和反轉錄，具體操作步驟詳見產品說明。以SYBR Green為熒光標記染料，茶樹GAPDH基因為內參基因，引物序列見表1。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）采用20μL體系：10μL SYBR?Green Supermix（Bio-rad），正向和反向引物各1μL（10μmol·L-1），cDNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。PCR反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環。每個樣品重復3次，反應結束后收集CT值進行分析。

1.5生物測定

蟲害苗和健康茶苗在裝置中放置3 d后，用于生物測定。實驗條件同茶苗處理。將初孵幼蟲接種對照C或處理T的第2葉進行取食，每葉2頭，并用透明尼龍網袋固定，每盆苗接種10頭，共接種5盆苗。茶尺蠖取食6 d后取下稱重（精確到0.1 mg）。

1.6多酚氧化酶活性測定

多酚氧化酶活性測定采用分光光度計法，以鄰苯二酚為底物，脯氨酸為催化劑，于460nm波長處測定吸光值的變化。以每分鐘變化0.01個OD值為1個酶活力單位（units），酶活性表示為：酶活力單位（units）/總蛋白含量（mg）/反應時間（min）（U·mg-1·min-1）。具體方法參詳見文獻[19]。

1.7數據分析

數據均在Win7操作系統下采用Statictica 6.0（Statistica，SAS，Institute，lnc.，Cary，NC，USA）軟件進行分析。兩種不同處理之間CsiLOX1和CsiACS1基因的表達水平的差異、PPOs活性的差異，以及茶尺蠖幼蟲在兩個不同處理上生長發育的差異分析采用獨立樣本t-檢驗。CsiLOX1和CsiACS1基因在對照、茶尺蠖幼蟲取食和蟲害苗處理和茶尺蠖幼蟲取食三者之間的差異顯著性分析采用單因素方差分析（ANOVA），如果方差分析差異顯著（P＜0.05），則進行Duncan’s新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1鄰近茶苗CsiLOX1和CsiACS1基因的表達水平

CsiLOX1和CsiACS1分別是茉莉酸和乙烯途徑上的關鍵合成酶基因[20-21]，在茶樹中已有報道。實驗結果表明，隨著暴露時間的延長，處理T中CsiLOX1的相對表達水平在24 h開始顯著升高，一直持續到72 h（圖2-A）；而CsiACS1的相對表達水平在12 h開始顯著升高，一直持續到48 h，但是在72 h與對照C相比，沒有顯著差異（圖2-B）。

2.2鄰近茶苗中CsiLOX1和CsiACS1受茶尺蠖幼蟲的誘導表達水平

TG取食6 h后，CsiLOX1的表達量比對照C提高3.0倍，而雙處理苗CsiLOX1的表達量比對照C提高5.0倍，且TG取食與雙處理之間具有顯著差異（圖3-A）。同樣地，TG取食和雙處理6 h均能顯著提高CsiACS1的相對表達水平，且雙處理的誘導表達水平顯著高于TG取食（圖3-B）。

圖2　茶尺蠖幼蟲為害對鄰近茶苗CsiLOX1（A）和CsiACS1（B）表達量的影響Fig. 2 The effects of TG-induced plant volatiles on the relative expression levels of CsiLOX1 （A）and CsiACS1（B）in neighboring tea plants

圖3　茶尺蠖幼蟲為害對鄰近茶苗茶尺蠖誘導的CsiLOX1（A）和CsiACS1（B）基因表達量的影響Fig. 3 The effects of TG-induced plant volatiles on the TG-induced relative expression levels of CsiLOX1（A）and CsiACS1（B）in neighboring tea plants

圖4　茶尺蠖幼蟲為害對鄰近茶苗茶尺蠖PPO活性(A)及對茶尺蠖初孵幼蟲體質量的影響(B)Fig. 4 The effects of TG-induced plant volatiles on PPO activity (A) and mass of freshly hatched TG larvae (B)

2.3茶尺蠖幼蟲為害苗誘導了鄰近茶苗的直接防御反應

暴露3 d后處理T葉片的PPO活性為(2.43±0.27) U·mg-1·min-1，顯著高于對照C（圖4-A）。初孵的茶尺蠖幼蟲在處理T上取食6 d后的體質量顯著低于對照C上的幼蟲體質量，為對照的76.1%（圖4-B）。

3 討論

植物的地上或地下部分均能感知由植食性昆蟲取食或產卵造成的機械損傷和某些來自蟲體的誘導物[22-24]，從而激活HIPVs的合成和釋放[4]。HIPVs作為化學信號可以在植物、植食性昆蟲與天敵之間傳遞，從而引起植物的直接或間接防御反應，并能引起鄰近植株的“竊聽”（Priming）行為[25-27]。茉莉酸和乙烯是植物（包括茶樹）體內兩條重要的抗蟲信號途徑，LOX和ACS是這兩個生物合成途徑上的關鍵酶[4,20-21]。大量研究結果發現，HIPVs可誘導臨近健康植株（“竊聽”植株）相關防御基因的表達、毒素或揮發性互益素的產生，從而直接啟動植物的防御體系[4,28-29]。我們的前期研究結果表明，茶尺蠖幼蟲為害可誘導茶樹多種揮發性有機化合物的產生，并且受不同為害密度和為害時間的影響[16,30]。本研究將健康苗與茶尺蠖幼蟲為害苗在保證氣體流通但不接觸的前提下放置于同一密閉容器中，即相當于將健康苗暴露于茶尺蠖幼蟲取食誘導的茶樹揮發物中，實驗結果表明暴露一定時間后茶樹處理T中CsiLOX1和CsiACS1基因的表達量顯著高于對照C（圖2），并且上述兩個基因在茶尺蠖幼蟲取食的處理T茶苗中的表達水平顯著高于茶尺蠖幼蟲取食過的對照C的表達水平（圖3）；進一步的研究還發現處理T葉片中多酚氧化酶的含量顯著高于對照C（圖4-A），在處理T取食6 d的初孵茶尺蠖幼蟲的體重顯著低于對照C（圖4-B）。綜上，我們的研究結果首次證實茶尺蠖幼蟲取食誘導的茶樹揮發物可以作為化學信號被鄰近茶苗所感知，并通過激活茉莉酸和乙烯途徑從而誘導鄰近苗的直接防御反應，這一現象與利馬豆Phaseolus lunatus L.、煙草Nicotiana attenuate L.、番茄Lycopersicon esculentum Mill.、榿木Alnusglutinosa上發現的相似[7-10]。本結果有益地補充了HIPVs作為化學信號物質在植物個體間傳遞的認識。

HIPVs的生態功能一直是化學生態學研究的熱點之一，它的多種組分均能在植物間傳遞化學通訊信號，如茉莉酸甲酯、水楊酸甲酯、乙烯、順-3-己烯醇、順-3-己烯基乙酸酯和羅勒烯等[5,14,31-33]。業已證明，順-3-己烯醇是茶尺蠖幼蟲取食誘導茶樹揮發物中的重要組分[16]，能夠誘導茶樹對茶尺蠖幼蟲的直接和間接抗性[14]。然而，茶尺蠖幼蟲取食誘導茶樹揮發物中的其他組分是否能夠誘導相似的防御反應尚有待進一步研究。因此，接下來我們將進一步挖掘蟲害誘導茶樹揮發物中具有抗性激發功能的單組分，從而將其發掘成為茶樹的抗蟲激發子，進而為茶樹害蟲的防治提供新型策略。

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Infestation of Ectropis obliqua Enhances Neighboring Tea Plant Defenses Against Conspecific Larvae

LEI Shu1,2, LI Xiwang2,3, SUN Xiaoling2,3, WANG Zhiying1*, XIN Zhaojun2,3*
1. Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

In this study, the effect of herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) from tea plant on the defense responses of neighboring tea plants was analyzed. The expression levels of defense-relatedgenes, the content of defense compound in tea and the mass of Ectropis obliqua (TG) larvae were measured respectively. Compared with the control plants, the results showed that HIPVs released from TG-infested tea plants significantly induced the relative expression levels of CsiLOX1 and CsiACS1 in the neighboring tea plants within 24 h and 12 h. TG-induced expression of CsiLOX1 and CsiACS1 were also enhanced by HIPVs. Three days after HIPVs exposure, the polyphenol oxidases（PPOs） activity in the treated tea leaves was 1.36-fold higher than that of control. Meanwhile, the HIPVs-treated tea plants reduced the performance of TG. The above results showed that volatiles released from TG-infested tea can convey information to those neighboring plants and then trigger the induced defense responses against TG by modulating JA and ET signaling pathways in tea.

Camellia sinesis, Ectropis obliqua, neighboring tea plants, induced defense response

S571.1；S435.711

A

1000-369X（2016）06-587-07

2016-08-03

2016-08-17

公益性行業（農業）科研專項經費（201403030）、國家自然科學基金項目資助（31272053、31401758）、浙江省科技廳公益技術研究農業項目資助（2015C32081、2016C32026）。

雷舒，女，碩士研究生，主要從事茶樹植物保護方面的研究。*通訊作者：zyw0451@sohu.com，xinzhaojun@mail.tricaas.com