綠茶提取物對紅曲黃酒釀造特性的影響

林曉婕，黃飛，何志剛，梁璋成，李維新

福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003

綠茶提取物對紅曲黃酒釀造特性的影響

林曉婕，黃飛，何志剛*，梁璋成，李維新

福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003

研究了綠茶提取物（Green tea extract, GTE）對紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉和酵母菌的生物量、產酶特性及其釀造特性的影響。在傳統紅曲黃酒釀造工藝的基礎上，添加不同濃度醇提取的GTE共發酵，研究GTE對紅曲霉和酵母的生長代謝產酶總量及紅曲黃酒出酒率的影響。結果表明，添加2%的GTE進行共發酵，純水提取的GTE和15%的乙醇溶液提取的GTE，其EGCG、ECG含量較低，對紅曲霉和酵母菌的生長、代謝產酶均有促進作用，與對照相比紅曲霉生物量分別提高2.4%和5.0%，產酶總量分別提高26.4%和47.8%，淀粉酶酶活分別提高了6.3%和11.8%；酵母菌生物量分別提高了9.4%和10.4%，產酶總量分別提高了21.2%和30.5%；出酒率分別提高了10.67和13.87百分點。75%的乙醇溶液提取的GTE，其EGCG、ECG含量較高，對紅曲霉產酶和酵母菌的生長、代謝產酶有抑制作用，與對照相比出酒率降低了9.28百分點。

綠茶提取物；紅曲黃酒；紅曲霉；酵母菌

福建紅曲黃酒以糯米為主要原料，紅曲米為糖化劑，用山泉精釀而成。傳統黃酒存在熱性高，易“上火”，色澤不穩定等問題[1-3]。為此，本課題組研究了影響紅曲黃酒寒熱性的相關因子，通過綠茶共發酵技術，研制出了溫和清爽型的紅曲茶黃酒。前期研究結果表明，在紅曲黃酒釀造過程中，添加綠茶共發酵，不但顯著降低了黃酒的熱度，而且有利于黃酒紅色、黃色色價的保持，同時可明顯提高黃酒的出酒率[4]，但添加綠茶共發酵對紅曲黃酒釀造特性的影響尚不明確。

紅曲霉、酵母菌是紅曲黃酒發酵過程中起到糖化發酵的關鍵微生物。紅曲霉是一種小型絲狀腐生真菌，能代謝產生淀粉酶、糖化酶、酯化酶等，其中，淀粉酶在紅曲黃酒釀造過程中起到液化作用。紅曲霉生長及產酶能力直接影響糯米的液化水平[5-7]。酵母是酒精發酵的關鍵菌，能夠在無氧條件下代謝糖產生酒精，其生長與產酶能力顯著影響釀酒過程中酒精發酵生成效率和最終產品品質[8]。因此，紅曲霉及酵母的生長及發酵能力將直接影響到出酒率。

本文研究不同濃度醇提取的綠茶提取物對紅曲霉、酵母菌的生物量、酶學及釀造特性的影響，以期為優化黃酒釀制工藝參數等提供理論依據，在溫和型黃酒釀造的深入開發和應用方面提供技術支持。

1 試驗材料

1.1原料

天山綠茶，寧德蕉城區市購；紅曲霉L-25、酵母菌JH301，由本實驗室自主選育、保存；古田平湖紅曲米，市購。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器

E2695型高效液相色譜儀及2998型光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；GX-04多功能粉碎機，上海高翔食品機械廠；KQ-300VDE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精密實驗設備有限公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；UV-1750紫外分光光度計，島津儀器有限公司；SPX智能型生化培養箱，寧波江南儀器廠；YXQ-LS-505II立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2.2試劑

標準品均購自美國sigma公司；淀粉酶試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為國產AR級。

1.2.3培養基

（1）紅曲霉活化培養基：NaNO30.2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，葡萄糖6%，蛋白胨2%，pH自然，加玻璃珠，121℃滅菌20min備用。

（2）紅曲產酶培養基：蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、可溶性淀粉3%、CaCl2·2H2O 0.05%、MnCl2·4H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%、pH 7.0～7.2、121℃滅菌20min備用。

（3）麥芽培養基：10%麥芽汁1 L，pH 5.4，121℃滅菌20min備用。

（4）酒精發酵培養基：稱取一定量的糯米，浸泡過夜后瀝干、蒸煮、冷卻至60℃左右，添加1.5倍的無菌水，再分別加入420 U·g-1的α-淀粉酶和3 360 U·g-1糖化酶，于60℃條件下酶解2 h，冷卻，配制成固形物含量約30%的糖化液，以乳酸調整pH值為4.0，離心后分裝于各發酵瓶中，煮沸10min，然后冷卻備用。

2 試驗方法

2.1綠茶提取物制備

為了模仿黃酒發酵過程中溶劑對綠茶活性物質的提取模式，因此選擇了發酵初期溶劑模式（即純水）和發酵終產物溶劑模式（即15%的乙醇溶液）分別提取綠茶活性物質，并參考多酚提取方式[9-10]選擇75%的乙醇溶液提取綠茶酚類物質。

綠茶用多功能粉碎機打成粉末，精確稱取適量粉末，固液比1∶20，分別加50mL的純水、15%的乙醇溶液、75%的乙醇溶液，超聲波100 Hz，40℃提取40min，分別得到純水提取的GTE（GTE1）、15%的乙醇溶液提取的GTE（GTE2）和75%的乙醇溶液提取的GTE（GTE3）[9-10]，分別分析其多酚含量。

2.2紅曲霉生長與產酶水平試驗

將紅曲霉接入活化培養基，30℃，150 r·min-1搖床培養6 d，備用。產酶培養基中分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化好的紅曲霉，接種量5%，30℃，150 r·min-1搖床培養6 d，檢測紅曲霉生長量、產酶情況[11]。

2.3酵母菌生長、產酶水平及發酵試驗

將酵母菌接入麥芽培養基，25℃恒溫培養24 h，備用。另取麥芽培養基，分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化的酵母菌，25℃過夜培養24 h，考察酵母菌的生長、產酶情況。

酒精發酵培養基中分別添加2%綠茶提取物GTE1、GTE2、GTE3，以添加2%的無菌水為對照（CK），接入活化好的酵母菌，接種量為5%，25℃下恒溫發酵，至發酵結束后，取發酵液4 800 r·min-1離心10min，取上清液，檢測酒精度、殘糖指標[12]。

2.4綠茶提取物對出酒率的影響

取5 kg容量酒壇，加入2.4 kg水，100g古田紅曲米，浸泡過夜。加入經浸泡、蒸煮、攤涼的糯米飯1.6 kg，分別加入質量分數為1‰的綠茶（GT）、2%的GTE1、GTE2、GTE3，攪拌均勻后在室溫下發酵，以加入2%的無菌水為對照（CK），發酵結束后檢測酒精度、出酒率和總酸。

2.5檢測方法

2.5.1酚類的測量方法

采用高效液相色譜法[13]測定多酚含量，采用GB/T 21733—2008茶飲料[14]中的方法測定總酚含量。

2.5.2氨基酸的測定

采用GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的測定[15]中所列方法測定氨基酸含量。

2.5.3菌體生物量的測定

霉菌生物量的測定：發酵液的菌絲體經過濾，60℃烘干，稱重，以重量法表示[11]；酵母生物量的測定：采用濁度計法[16]，發酵液稀釋10倍后，在660nm下檢測吸光度，扣除綠茶提取物的吸光度，以濁度增量OD600表示酵母生長量。

2.5.4霉菌、酵母菌產酶總量的測定

發酵液離心取上清液，分別以添加2%的無菌水、GTE1、GTE2、GTE3的培養基為空白，采用考馬斯亮藍法[17]測定上清液蛋白質含量，以蛋白質含量表示產酶總量。

2.5.5淀粉酶酶活的測定

采用試劑盒法測定上清液淀粉酶酶活力[18]。淀粉酶酶活定義：樣品的淀粉酶酶活力單位即1g紅曲米在40℃、pH 6.0的條件下，1 h液化1 mg可溶性淀粉，即為1個淀粉酶酶活力單位（U·g-1）。

2.5.6酒精度及總糖的測定

酒精度：采用高效液相色譜法測定[19]；殘糖、總酸測定：參考GB/T 13662—2008 黃酒[20]中總糖、總酸的檢測；出酒率：以成品酒15°計，按以下公式計算：出酒率%=酒精度%×出酒量（kg）/大米用量（kg）/15%

2.6數據分析

采用DPS數據軟件進行顯著性分析。

3 結果與分析

3.1綠茶提取物的主要生化成分

由圖1可知，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增大，總酚得率明顯上升，當提取液為75%乙醇水溶液時，總酚含量高達2.022 mg·mL-1。這可能是因為鞣質、酚類具有較強的極性，易溶于乙醇等極性溶劑。圖1和表1說明，提取物中含有豐富的蛋白質、糖類和氨基酸等營養物質。從表2中可以看出，提取物GTE3中EGCG和ECG含量分別為1.243 mg·mL-1和0.263 mg·mL-1，隨著提取溶劑中乙醇濃度的增大，酯型兒茶素EGCG、ECG含量明顯增加，這與劉湘、王增盛等的研究[21-22]相符。

圖1　綠茶提取物的主要營養成分Fig. 1 Essential nutrient ingreen tea extracts

表1　綠茶提取物的氨基酸含量Table 1 Amino acids ingreen tea extracts

表2　綠茶提取物的多酚含量Table 2 Polyphenols ingreen tea extracts

3.2綠茶提取物對紅曲霉生長及產酶特性的影響

綠茶提取物對紅曲霉生長代謝相關指標的影響結果如表3所示。從表中可以看出，與CK相比，添加GTE1的紅曲霉生物量提高了2.4%，達顯著水平（P＜0.05），產酶總量和淀粉酶酶活分別較CK提高了26.4%和6.3%，達極顯著水平（P＜0.01）。添加GTE2的紅曲霉生物量、產酶總量和淀粉酶酶活分別較CK提高了5.0%、47.8%和11.8%，三者均達極顯著水平（P＜0.01）?？梢哉f明，水和低濃度醇溶劑提取的GTE1和GTE2中EGCG、ECG含量都較低，對紅曲霉生長、代謝產酶有促進作用。這也間接說明，在發酵后期，隨著酒體的變化，綠茶浸出物內溶物質的改變，提取物對紅曲霉生長和產酶代謝的促進作用逐漸加大。GTE3對紅曲霉的生長雖然沒有明顯的抑制作用，但產酶總量較CK下降10.4%，達顯著水平（P＜0.05），可以說明，GTE3對紅曲霉的產酶代謝有抑制作用，這可能是因為較高濃度的茶多酚能夠下調曲霉相關基因的表達[23-24]。

3.3綠茶提取物對酵母菌生長及產酶總量的影響

綠茶提取物對酵母菌生長代謝的相關指標測定結果如表4所示。表4表明，與CK相比，添加GTE1和GTE2處理的生物量分別提高了9.4%和10.4%，產酶總量分別較CK提高了21.2%和30.5%，均達極顯著水平（P＜0.01）；酒精度分別較CK高0.18和0.25百分點，殘糖降低了23.8%和26.0%，可以說明，GTE1和GTE2中EGCG、ECG含量較低，對酵母菌生長和產酶總量有促進作用，進而促進了酵母代謝糖類產生酒精。與CK相比，添加GTE3處理的生物量和產酶總量分別下降了7.4%和8.5%，酒精度下降了0.42百分點，殘糖提高了2.9倍，可以說明，GTE3中EGCG、ECG含量較高，對酵母菌生長和產酶代謝有抑制作用，因此，降低了糖類的轉化率，降低了發酵產物的酒精度。付慧等[25-27]在茶多酚對酵母等真菌生長代謝影響的研究中表明，茶多酚對真菌無抑制作用。Yongli Wang[28]等研究表明，在茶多酚低添加量（100mg·kg-1）的條件下，培根中酵母菌的微生物總數較空白對照增加；在高添加量（＞200mg·kg-1）的條件下，培根中酵母菌微生物總量下降。這可能是因為低濃度的EGCG、ECG促進了酵母菌的生長，而高濃度的EGCG、ECG抑制了酵母菌的生長，與本文研究結果相符。

表3　綠茶提取物對紅曲霉生長及產酶特性的影響Table 3 Effects ofgreen tea extracts on thegrowth of monascus and productivity of enzymes

表4　綠茶提取物對酵母菌生長及產酶總量的影響Table 4 Effects ofgreen tea extracts on thegrowth of yeasts and productivity of enzymes

3.4綠茶提取物對出酒率的影響

分別將綠茶和3種提取物加入紅曲黃酒進行共發酵，考察綠茶與各提取物對黃酒品質的影響，發酵結束后檢測結果如表5所示。由表5可知，紅曲黃酒CK的酒精度和出酒率分別為11.03%和218.33%。添加綠茶、GTE1、GTE2的紅曲黃酒酒精度分別較CK高0.52、0.50和0.52百分點，出酒率分別較CK高15.4、10.67和13.87百分點，均達到極顯著水平（P＜0.01），三者之間無顯著差異，可以說明，三者對紅曲黃酒的出酒率均有顯著的促進作用，GTE1和GTE2對紅曲黃酒釀造產物的影響和綠茶的影響較為接近。添加GTE3的紅曲黃酒酒精度和出酒率分別較CK降低了0.35和9.28百分點。在試驗中還發現，添加綠茶、GTE1和GTE2的紅曲黃酒總酸較CK低了1.0g·L-1左右，添加GTE3的紅曲黃酒總酸較CK低約1.5g·L-1，可以說明，綠茶及其提取物都能抑制酒體產酸。當添加的提取物總酚含量超過2mg·L-1時，酒體的抑制酸化效果大大增加。付慧[25]等在茶多酚對細菌生長代謝的影響研究中發現，茶多酚對細菌有較強的抑制活性。由于茶多酚抑制了細菌的生長代謝，抑制了細菌對營養物質的競爭利用，從而抑制了黃酒酸化。

表5　綠茶提取物對紅曲黃酒釀造出酒率的影響Table 5 Effects ofgreen tea extracts on alcohol yield of hongquglutinous rice wine

4 結論與討論

本試驗結果表明，GTE1和GTE2能促進紅曲霉和酵母菌的生長代謝和產酶，從而提高紅曲黃酒的出酒率，原因可能有以下三點，第一，GTE中茶多酚主要為酯型兒茶素EGCG和ECG，釀酒酵母和曲霉能以之為碳源進行代謝[29]，在發酵過程中，霉菌或酵母菌產生單寧酶，水解酯型兒茶素[30]；第二，GTE1和GTE2中微量的EGCG、ECG等兒茶素，提高了微生物的抗氧化能力[31]，有利于保護細胞膜結構[19]，延長酵母菌和霉菌的時序壽命（Chronological life span，CLS），從而促進了霉菌的代謝和酵母菌的生長代謝；第三，GTE1和GTE2的提取溶劑為強極性溶劑，提取液中含有種類豐富的糖類、氨基酸、蛋白質等物質，為酵母提供了生長所需的碳、氮源[32]。Helena Orozco等[33]研究發現，氨基酸能補充酵母新陳代謝中的氨基酸不足，延長酵母最長壽命（Maximum life span），并在酒類發酵后期保持細胞完整性。高醇濃度溶劑提取的GTE3中EGCG、ECG含量較高，反而起抑制作用，EGCG、ECG能附著于酵母細胞膜上，與蛋白質結合降低酵母細胞膜的透性，與糖蛋白結合降低細胞膜的流動性，并最終導致細胞死亡[33]，從而抑制了酵母菌的生長代謝和產酶。GTE3對紅曲霉代謝產酶的影響可能類似于酵母菌，其作用機制有待進一步研究。

添加綠茶提取物能抑制黃酒酸化，主要原因可能是茶多酚能引起細菌細胞壁和細胞膜損傷，降低細菌細胞膜穩定性，增加細菌細胞膜通透性，致使細胞周質和胞內酶等組分發生泄漏，使細菌內的物質運輸、能量轉化、信息傳遞等生理代謝發生紊亂，進而導致細菌活性下降，引起細菌死亡[34-35]在發酵過程中，黃酒中的大部分有機酸主要由乳酸菌等細菌產生，釀造過程中添加茶多酚，使產有機酸的乳酸菌得到抑制。

由于綠茶種類很多，不同產地、不同加工工藝的綠茶，其EGCG、ECG、氨基酸等物質含量也有差別。不同來源綠茶的提取物，以及EGCG、ECG純品對紅曲黃酒釀酒品質的影響也有差別，對發酵關鍵微生物紅曲霉、酵母菌和乳酸菌等作用機制的研究還有待進一步深入。

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Effects of Green Tea Extracts on Brewing Characteristics of Hongqu Glutinous Rice Wine

LIN Xiaojie, HUANG Fei, HE Zhigang*, LIANG Zhangcheng, LI Weixin
Institute of Agricultural Engineering Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fujian Key Laboratory of Agricultural Product (Food) Processing, Fuzhou 350003, China

The effects ofgreen tea extracts on the biomass of monascus and yeasts, productivity of enzymes and brewing characteristics were investigated. Based on traditional fermentation technology for hongquglutinous rice wine,green tea extracts by different ethanol solvents were added for fermentation and their effects ongrowth and metabolites of monascus and yeasts as well as alcohol yield were studied. The results showed that when 2% GTE was added for fermentation,green tea extracts by water or 15% ethanol-water solution resulted in relatively low EGCG and ECG. Moreover, they also exhibited promoting effects ongrowth of monascus, yeasts and the metabolites of enzymes. For example, the biomass of monascus increased by 2.4% and 5.0%, the productivity of enzymes increased by 26.4% and 47.8%, diastase activity increased by 6.3% and 11.8%, the biomass of yeasts increased by 9.4% and 10.4%, the productivity of enzymes increased by 21.2% and 30.5%, the enzyme activity increased by 6.3% and 11.8%, the alcohol yield increased by 10.67 and 13.87 percent point with the control. Extracts ofgreen tea by 75% ethanol-water solution led to the highest EGCG and ECG, which exhibited negative effects on thegrowth of monascus and yeasts and the productivity of enzymes in monascus. The alcohol yield also decreased by 9.28 percent point.

green tea extracts, hongquglutinous rice wine, monascus, yeast

TS272.5+1；TS261.4

A

1000-369X（2016）06-631-08

2016-06-15

2016-08-23

福建省屬公益類科研院所基本科研專項（2014R1015-5、2016R1014-7）、福州市科技項目（2015-G-75）。

林曉婕，女，碩士，助理研究員，主要從事食品資源開發與利用研究，E-mail：njgzx@163.com。*通訊作者