下一代測序技術在遺傳病臨床檢測中的應用

楊學習

·述評·

下一代測序技術在遺傳病臨床檢測中的應用

楊學習★

DNA測序技術已廣泛應用于生物學研究，很多生物學問題也都可以借助測序技術予以解決。過去10年（2005?2015年），下一代測序技術（nextgeneration sequencing，NGS）逐步從新技術成長為主流的測序技術，并逐漸走進臨床診斷領域。NGS以其簡單、快速、高分辨率、高通量的特點，在傳染性疾病防控、腫瘤的早診早治、遺傳病的早期篩查和診斷、無創產前篩查、胚胎植入前診斷和篩查等領域發揮越來愈大的作用，已成為目前臨床領域最具有應用前景的技術之一。同時下一代測序技術領域仍在快速發展，新的測序技術及數據分析技術還在不斷涌現，序列數據庫和測序數據快速增加。下一代測序技術也有助于以更低廉的價格，更全面、更深入地來分析基因組、轉錄組及蛋白質相互作用組的各項數據。可以預見，各種測序將成為一項廣泛使用的常規實驗手段，有望給生物醫學研究領域和醫學臨床診斷帶來革命性的變革。本文主要針對下一代測序技術在無創產前診斷、遺傳病檢測、胚胎植入前診斷和篩查中的臨床應用進行介紹和評述。

下一代測序；染色體非整倍體無創產前篩查；遺傳病檢測；胚胎植入前診斷和篩查

DNA測序技術是生命科學領域里一項創造性的發明，從早期基于Sanger法開發的第一代自動化測序儀到下一代測序（next generation sequenc?ing，NGS）技術平臺的發展，已經使生命研究的基本元素發生了轉變——從單一、局部的基因或基因的片段轉變成多基因、多片段甚至整個基因組；反過來，這種轉變又需要更加強大的測序技術來支持，測序技術與其應用之間的協同關系使得兩者的發展在可預見的未來內保持這種趨勢，并且為其對生命科學研究和臨床應用的巨大前景的推動作用而加速。

近幾年國內NGS市場異常火爆，測序公司不斷涌現。而且已有多家NGS公司迅速涌入臨床領域，開展基于NGS的臨床檢測服務，如：染色體非整倍體無創產前篩查、百種甚至千種遺傳病產前診斷、腫瘤個體化治療相關基因多態性位點檢測、單基因和多基因疾病的易感基因遺傳檢測和咨詢等項目。2014至2015年，國家食品藥品監督管理總局（China Food and Drug Adm inistration，CFDA）先后批準了華大基因、中山大學達安基因股份有限公司、北京博奧晶典生物技術有限公司和北京貝瑞和康生物技術有限公司的高通量測序儀和測序試劑，使染色體非整倍體無創產前診斷成為現實，開創了高通量測序在臨床應用中的新局面并引起了社會的廣泛關注。多家公司相繼啟動基于NGS測序技術的包括腫瘤靶向用藥及療效相關基因位點檢測、遺傳病篩查和診斷、胚胎植入前診斷和篩查相關試劑盒的CFDA注冊工作。同時，以華大基因、中科紫鑫科技有限公司、深圳華因康基因科技有限公司、深圳市瀚海基因生物科技有限公司、上海小海龜科技有限公司為代表的公司也積極研發具有自主知識產權的基因測序儀。在不遠的將來，NGS將成為一項廣泛使用的常規實驗手段，有望給生物醫學研究領域和醫學臨床診斷帶來革命性的變革。本文將主要針對NGS技術在無創產前診斷、遺傳病檢測、胚胎植入前診斷和篩查中的臨床應用進行介紹，以示其較為系統的面貌。

1 NGS在染色體非整倍體無創產前診斷中的應用

染色體非整倍體無創產前診斷是NGS在臨床應用上的一個成功典范，極大地推動了NGS在臨床中的應用和發展。染色體非整倍體是最主要的胎兒染色體異常遺傳性疾病，以21三體、18三體和13三體為主要形式。目前非整倍性染色體疾病尚無有效治療方法，唯一有效的措施為廣泛開展產前篩查與診斷［1］。但常規唐氏綜合征產前篩查普遍存在假陽性和假陰性較高的問題，且通過羊膜穿刺和胎兒絨毛取樣獲得胎兒DNA通常會造成1％的流產率［2］。1997年，在孕婦血漿和血清中發現了胎兒游離DNA片段［3］，這為無創性產前基因檢測帶來新的希望。2008年，首次通過對母親血漿胎兒游離DNA（cell?free fetal DNA，cffDNA）進行NGS分析來檢測三體［4?5］，隨后大樣本研究表明利用NGS技術進行染色體非整倍體的無創產前診斷非常有效［6］。因其具有無創取樣、無流產風險、高靈敏度、高準確性（≥99％）等特點，通過采集孕婦外周血、提取游離DNA、采用NGS技術、結合生物信息分析這一方法，已成為目前染色體非整倍體產前篩查與診斷技術的主要手段。多個聯盟組織［例如，美國婦產科醫師協會（the American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG），美國醫學遺傳學會（the American College of Medical Genet?ics and Genom ics，ACMG），國際產前診斷學會（the International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）］正在極力推進這項技術的臨床應用［7?9］。在看到NGS技術強大能力的同時，我們也必須清醒地意識到胚胎胎盤不一致，嵌合體、胎兒DNA濃度、孕婦本身攜帶微缺失微重復或患有婦科腫瘤、雙胎消失綜合征等原因對該技術臨床應用帶來的局限性。尤其是胎兒DNA在母體血漿的濃度是影響檢測結果的常見因素。胎兒DNA在母體血漿中的濃度一般為10％～15％，但也可能少于3％或多于30％［10?11］，在胎兒DNA濃度少于3％的樣本中使用NGS技術其結果是不太可信的。另外，胎兒DNA濃度在3個方面影響著染色體非整倍體診斷的應用。首先，當胎兒DNA濃度增加時，唐氏綜合征的結果也會更顯著。其次，胎兒DNA濃度受孕婦體重影響最大，對于體重較大的孕婦，胎兒DNA濃度會低，假陰性比率會增高。最后，在嵌合體中，胎兒DNA濃度的有效部分會減少，這也會影響檢測的準確性。

2 NGS在遺傳病檢測中的應用

NGS相對于傳統的Sanger測序法有很多優

點，最明顯的是它可以在較短的時間和較低的成本下做批量檢測（panel testing）。對于許多表型上類似但由很多不同遺傳因素造成的遺傳異質性疾病（如遺傳性耳聾、先天性肌營養不良、先天性疾病糖基化），以及在同一個通路中不同的基因突變所導致的代謝性疾病全部突變的篩選、有很多變量卻有相同靶標的一系列疾病（如線粒體缺陷），NGS是一個有時間和成本效益的技術工具［12?14］。下文將通過簡短介紹基于下一代測序技術的幾種遺傳性疾病和相應的基因檢測試劑盒（panel），討論下一代測序技術在遺傳性疾病檢測中的進展以及探討怎樣通過下一代測序技術來解決遺傳異質性的問題。

2.1 遺傳性耳聾

耳聾是最常見的感覺神經性聽力損失出生缺陷疾病。大約2/3的耳聾來源于遺傳因素，而剩余的1/3來源于環境［15?16］。常規芯片和核酸質譜篩查未能發現的陽性樣本，對造成聽力缺陷的所有基因進行測序是經常采用的方法。絕大部分的實驗室對候選基因的編碼區和兩側序列用Sanger測序法來進行檢測。然而，聽力缺陷極大的遺傳異質性導致用Sanger測序法將耗費大量的金錢和時間。而NGS技術則可以對大量基因序列進行便宜、快速的多重平行測序。

Shearer等［17］設計的綜合性診斷平臺可以檢測包括先天性聾視網膜色素變性綜合征在內的54個已知的非綜合征型耳聾基因。在6個突發性非綜合征型耳聾病人里有5個病人在STRC、MYO6、KCNQ4、MYN14和CDH23上發現了非綜合征型耳聾突變位點，包括3個新的突變位點。Licastro等［18］設計的Usher綜合征基因的診斷panel在12個Usher綜合征患者中的10例中檢測到位于MY07A、CLRN1、GPR98、USH2A和PCDH15中的11致病突變。另外2個研究小組則分別設計了針對34個常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾基因和24個神經性耳聾基因的檢測panel［19?20］。Siva?kumaran等［19］通過與5個基因（GJB2，CDH23，MYO7A，EYA1和OTOF）394個變異位點的Sanger法鑒定結果對比，NGS和Sanger法的一致性高于99.99％。Schrauwen等［20］設計的panel中，24人中9人被確診，達37.5％。6個患者被發現是純合子變異，3個患者為復合雜合子變異。結果還顯示一位患者可能具有OTOF和SLC26A4雙基因型遺傳模式［19］。

2.2 遺傳性神經肌肉障礙

遺傳性神經肌肉障礙（inherited neuromuscular disorders，NMD）是一組導致長期殘疾的遺傳性疾病，包括超過200種單基因疾病。在這些疾病中，有超過一半的分子機制目前尚不清楚。如果想要準確診斷，通常需要結合臨床表現進行大規模一個接一個的基因檢測。由于遺傳異質性和散發病例缺少等位基因的分離，想要做出診斷十分昂貴、耗時并具有挑戰性。NMD關聯基因眾多，還有一些致病基因特別長，從而使整個基因進行Sanger測序耗時耗力。對于病人來說，這種逐個基因排查法進行病因診斷，增加了檢測數，因此會導致診斷的延遲、并使病人接受不必要的檢查和治療，還妨礙了采取針對性有效治療方案的實施從而增加了疾病在家族中再發的風險。

Vasli等［21］開發了一種有效的篩查遺傳異質性神經肌肉疾病相關基因的panel，包括267個已知的NMD相關基因（1.6Mb目的區域）。在已鑒定的病人和沒有進行分子診斷的病人中，檢測到了所有已知的突變位點［21］。在8個陽性對照組中，所有的突變類型都被檢查到。在一例杜氏肌肉萎縮病人檢測到了DMD（duchennemuscular dystro?phy）基因18～44外顯子的大片段缺失。在2個共濟失調的患者中發現存在于SETX的2個突變。還在RYR1、TTN和COL6A3上發現了幾個潛在致病性突變位點，并通過Sanger測序和等位基因分離證實［21］。但Vasli等［21］未能在4個分子診斷不清楚的病人中尋找到致病基因。Xie等［22］通過panel測序對DMD基因突變進行檢測，在一個中國家系（包括先證者以及先證者已被診斷出假肥大型肌營養不良的堂兄弟）DMD第79號外顯子上發現了2個相同的突變位點，其中c.10141C＞T、NM_ 004006.1是其致病性突變，會產生缺失羧基端的截短的肌營養不良蛋白。Valencia等［23］則針對先天性肌營養不良（congenitalmuscular dystrophy disor?ders，CMD）進行panel檢測，包括12個基因的321個外顯子（65 kb目的區域）。以一個12個CMD基因都通過Sanger測序驗證的正常人作為陰性對照，5個具有已知突變的樣品作為陽性對照，6個具有CMD臨床特征但尚未進行CMD基因檢測病人作為研究對象，其診斷率為41％，而單基因檢測的診斷率為17％。杜氏肌營養不良和Becker型肌營

養不良是最常見的兒童肌營養不良癥［24］，可以通過對DMD基因進行基因檢測來確診。Lim等［25］設計的panel可對DMD/BMD進行全面性的突變譜研究。研究對象包括25名患者，其中16名無大片段缺失/重復但患有肌營養不良蛋白表達缺陷的患者，9名是存在大片段缺失/重復的患者。在大部分（15/16）沒有大片段缺失/重復的患者中都檢測到小的突變。以這16個患者作為基準，準確地預測出了9名已知突變患者的外顯子大片段缺失/重復。16名患者中有15名檢測到致病性突變，突變檢測率及突變類型（12個無義突變，2個引起移碼突變小缺失，和一個剪接突變）與對照方法得到的結果一致。

2.3 線粒體疾病

線粒體疾病的臨床表現多樣，遺傳方式獨特，可由核或線粒體基因組的突變引起［26］。已發現約有70個核基因與線粒體疾病有牽連，但仍有許多基因未知。由于線粒體疾病常表現為非特異性，因此同時檢測m tDNA和nDNA的基因突變是有意義的。Vasta等［27］設計的包含線粒體基因組以及額外的1 000個核基因的panel，通過對42例具有線粒體氧化磷酸化臨床及生化特征的無血緣關系幼兒患者的檢測，發現55％（23/42）患者含有隱性基因或致病突變的m tDNA變異體，其中10例患者（24％）可以確定具有與疾病相關的基因突變，13例患者（31％）具有尚不明確的核基因突變。表明NGS技術應用于線粒體相關疾病的臨床診斷十分具有潛力。

與傳統的通過Sanger逐步測序檢測關聯基因的檢測方法相比，基于NGS panel設計具有成本和速度優勢，適用于多個潛在候選致病基因的高度遺傳異質性疾病和由于同一個超大基因多個致病突變位點引起的單基因病的分析。基于panel的NGS方法的不足在于它不是包含所有與疾病相關的基因和基因區域，這是由于目的片段大小的限制或者剛被發現的未包括在panel上的疾病相關基因。全外顯子測序和全基因組測序有可能可以對沒有明確分子診斷病人中找到致病突變和/或基因，這些可以增加到現有的panel中去。然而與靶向panels相比，作為常規的分子診斷方法，全基因組或者全外顯子組的方法要有更高的覆蓋度，并且會降低敏感性和異質性的評估能力［28］。而在低覆蓋率下測序更多的基因將會增加假陰性的風險，增加假陽性位點的個數，而這些假陽性位點又需要漫長的時間來驗證。綜合考慮目前panel檢測的目的區域覆蓋度、敏感性和特異性，目前panel測序還不能夠完全替代Sanger測序。把Sanger測序法作為驗證和補充技術是非常必要的。另外，要將panel測序運用到臨床，還需要依據具體的捕獲方法和測序平臺確定每個panel的敏感性和特異性。

3 NGS在胚胎植入前遺傳學篩查中的應用

胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genet?ic diagnosis，PGD）/胚胎植入前遺傳學篩查（preim?plantation genetic screening，PGS）是指在體外受精過程中，對具有遺傳風險患者的胚胎進行種植前活檢和遺傳學分析，以選擇無遺傳學疾病的胚胎植入宮腔，從而獲得正常胎兒的診斷方法，可有效防止有遺傳病患兒的出生。不孕不育已成為當今影響人類繁衍和家庭問題的疾病之一，試管嬰兒技術給不孕不育夫婦們帶來了希望。但通過試管嬰兒方法獲得的胚胎40％～60％存在染色體異常［29?30］，而染色體異常是導致妊娠失敗和自然流產的主要原因，也是體外受精最終失敗的主要原因之一［31］。健康的胚胎是試管嬰兒成功的第一步，植入前遺傳學篩查技術也因此越來越受到重視。

PGS/PGD的通用檢測手段包括PCR、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH），比較基因組雜交（array comparative genom ic hybrid?ization，aCGH）、NGS技術等。其中aCGH、單核苷酸多態性（single?nucleotide polymorphism，SNP）關聯分析以及NGS使得檢測結果更為準確。聯合應用單細胞全基因組擴增技術和NGS可以同時檢測單基因病和染色體非整倍性，準確率超過了99％［32］。2014年，世界首例經NGS進行單基因遺傳病篩查的試管嬰兒，在北京大學第三醫院誕生［33］。北京嘉寶仁和醫療科技有限公司、貝瑞和康生物技術股份有限公司、江蘇億康基因科技有限公司、安諾優達基因科技（北京）有限公司、蘇州貝康醫療器械有限公司等相繼通過第三方檢驗、科研合作等方式為生殖中心提供PGS/PGD服務。2016年，CFDA相繼通過了杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司、北京中儀康衛醫療器械有限公司（北京嘉寶仁和醫療科技有限公司全資子公

司）、蘇州貝康醫療器械有限公司關于胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒的創新醫療器械特別審批申請，表明PGS有望很快走入臨床。而且隨著測序技術成本大幅度降低、遺傳學機制研究的推進和生物信息數據分析的深入，以及國家“全面二胎”政策發布和平均生育年齡的明顯提升，基于NGS的胚胎植入前染色體非整倍體篩查會有更大市場空間。

4 結語

隨著NGS的發展，更低成本和更快速度產生大量的測序數據終將提高對遺傳性疾病的診斷效率。在最近的幾年中，NGS向臨床領域的轉入速度正在穩步提升，特別在其絕對優勢領域—檢測由大量基因引起的遺傳異質性疾病或者同時檢測某個通路中的很多基因突變的應用上轉化更快。我們相信，基于NGS的panel檢測以及仍在快速發展的外顯子組檢測和全基因組檢測在遺傳性疾病的檢測中將發揮更大的作用。

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Progressof the app licationsof next generation sequencing technology in clinical diagnosticsof genetic disorders

YANG Xuexi★
（School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

DNA sequencing isw idely used in biology research,and many biological problems only can be solved by sequencing technology.In the past 10 years(2005-2015),next?generation sequencing has developed from a newborn technology to amainstream technology,and has been gradually applied to clinical diagnosis.W ith a simple,fast,high?throughput,and high?resolution feature,nextgeneration sequencing hasbeen believed to be one of the most potential technology in clinical tests,especially in infectious disease prevention, noninvasive prenatal diagnosis,genetic disorders identification and diagnosis,cancer early diagnosis and treatment,and preimplantation genetic screening field.Meanwhile,next?generation sequencing technology is still grow ing quickly,new sequencing and data analysismethods are constantly emerging,sequence database banks and sequencing data are rapidly increasing.Sequencing technology development lead analysis genome, transcriptome,and protein?protein interaction datamore deeply,comprehensively and cheaply.Sequencing w ill be a w idely used method in the routine lab test and w ill be a revolutionary change in biomedical research and clinical diagnosis.The presentpaperw illbriefly review the application of nextgeneration sequencing in the field of noninvasive prenataldiagnosis,genetic disordersdiagnosis,preimplantation genetic screening.

Next generation sequencing;Noninvasive prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies;Genetic disordersdiagnosis;Preimplantation genetic screening/diagnosis

廣東省科技計劃（2015A030401040）；廣州市科技計劃（201604020104）

南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學習，E?mail：yxxzb@sohu.com