人類癌癥特異敏感標志物：循環腫瘤DNA

吳龍 王穗海 梁志坤★

·綜述·

人類癌癥特異敏感標志物：循環腫瘤DNA

吳龍1王穗海2梁志坤1★

循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由腫瘤細胞釋放到血液循環系統中的DNA，它可作為多種癌癥的生物學標志物。ctDNA的檢測具有操作簡便快速、無創、特異性和高敏感性等特征，以下一代測序（next?generation sequencing，NGS）技術為基礎的ctDNA分析方法可通過突變狀態反映腫瘤基因組信息，在腫瘤的研究領域和臨床應用發揮重要的作用，可決策一個全新的癌癥治療方案。ctDNA作為新興的“液體活檢”靶標，其具有廣闊的應用前景和推進精準醫療的實施。本文概括了ctDNA在多種癌癥（乳腺癌、肺癌和結直腸癌）中的高頻率突變基因、ctDNA的最新檢測技術和ctDNA在臨床診斷、療效監控及預后判斷中的良好效果，以推動NGS技術為基礎的ctDNA檢測方法在臨床醫學中的應用。

ctDNA；下一代測序；腫瘤；液體活檢

組織活檢作為癌癥診斷、分期和治療決策的主體，其角色已從簡單的組織學檢查演變為復雜的遺傳分析。盡管它很有效用，但僅僅代表一個位置單個時間點的狀態，往往不足以描述整個惡性腫瘤的情況及其演變過程，因為附近組織可能包含更多的遺傳信息會影響到分期和治療。而且侵入性和活檢固有的選擇偏好性也限制了其作為實時監控工具的有用性。為了克服這一缺點，人們開始尋找各種腫瘤生物標志物，如蛋白質標記物，循環腫瘤細胞和循環腫瘤DNA（circulating tu?

mor DNA，ctDNA）等。近幾年，研究表明腫瘤患者ctDNA所攜帶的腫瘤突變信息與腫瘤組織具有良好的一致性［1?3］，因此腫瘤循環DNA引起了人們的極大關注。Newman等［4］發明的高敏感度ctDNA定量檢測技術：腫瘤個性化深度測序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP?Seq），使得ctDNA的檢測有了突出的進步，從而使檢測血液樣品中低濃度ctDNA成為可能，進而能夠跟蹤腫瘤的發展狀態。本文就ctDNA在多種腫瘤診療中應用的情況及在腫瘤的診斷、療效監測及預后判斷等方面的潛在作用進行介紹，以推動下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）技術為基礎的ctDNA檢測方法在臨床醫學中的應用。

1 ctDNA的特性

循環腫瘤DNA（ctDNA）指的是由腫瘤細胞釋放到血液循環系統中的DNA。而細胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA），或者叫血漿游離DNA，是指血漿中游離存在的DNA，它們有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞），還有部分來自于人體外部（如病毒DNA）。正常cfDNA與ctDNA的區別在于是否存在突變。體細胞突變，只在癌細胞或癌前細胞的基因組中，通常是單堿基對取代，卻不會存在于同一個體的正常細胞的DNA中，這樣才能保證ctDNA作為特異性的生物標記物。

2 腫瘤患者中的ctDNA

在20世紀40年代后期第一次在人體循環中發現游離的DNA，隨后在20世紀70年代分離出了腫瘤特異性遺傳物質。然而，ctDNA檢測的發展相當緩慢，甚至落后于產前診斷。ctDNA面臨的挑戰包括充滿變異，且血液中的ctDNA濃度較低，特別是在早期腫瘤，這阻礙了它的快速發展和更好地融入臨床實踐。幸運的是，靶向選擇和擴增方法技術以及測序方法的進步促進了這些微量ctDNA的檢測。一種被稱為磁珠乳液擴增（beads emulsion amplification and magnetics，BEAM ing）的方法［5］，它能夠靶向選擇以增強靶區域的捕獲效率，使捕獲的靈敏度高達0.01％［6］。這樣精準的檢測能力使研究人員能夠探索ctDNA的臨床適用性，對癌癥進行實時監控。

2.1 乳腺癌患者中ctDNA

轉移性乳腺癌需要對腫瘤的負荷進行監控，以確定對治療的反應，并且選擇適宜的生物標志物。Dawson等［3］通過對PIK3CA和TP53的點突變進行檢測，發現30位女性中有29位（97％）的體細胞基因組發生突變，成功地檢測到ctDNA，其表達水平波動較大，并且波動與腫瘤負荷呈現出顯著的相關性。與此同時，ctDNA比癌抗原15?3（CA15?3）和循環腫瘤細胞的檢測具有更高的靈敏度。Heidary對轉移乳腺癌相關基因（PCDH20，OR4X1，ALK，DNPEP，SH3TC2，DDR2，MLL3，PIK3CA）的檢測，同樣發現ctDNA水平表現出較大范圍的波動［7］。現在，40％乳腺癌患者存在PIK3CA（I類磷脂酰肌醇?3?激酶（PI3K）催化亞基）的體細胞突變，而PIK3CA則是調節PI3K信號轉導所必須。通過對COSM IC數據庫的檢索同樣可以發現乳腺癌患者中的PIK3CA和TP53這2個基因是高頻率突變基因［8］。毫無疑問，在乳腺癌診斷中，ctDNA將有望成為替代癌抗原15?3（CA15?3）和循環腫瘤細胞成為新的腫瘤生物標志物，而對PIK3CA和TP53進行檢測則可以很好反應乳腺癌狀態。

2.2 肺癌患者中ctDNA

Maheswaran等［9］在肺癌細胞中檢測到EGFR和KRAS基因的突變，揭開了肺癌靶向治療的可能路徑。Yung等［10］使用數字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）技術在非小細胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）患者的血漿ctDNA中檢測到表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）突變，其外顯子19缺失和L858R突變頻率分別為17％和26％，與腫瘤樣本的測序結果相比較，腫瘤樣本中EGFR突變的敏感性和特異性分別為92％和100％，同時，突變序列的數量和臨床應答呈相關關系。Punnoose等［11］也觀察到在血漿中ctDNA中EGFR突變的狀態與相應的腫瘤組織大小是一致的，這意味著可以使用ctDNA實時評估突變狀態。Wang等［12］發現在非小細胞肺癌患者血漿ctDNA中，KRAS突變和相應腫瘤組織也呈相關關系，在血漿和腫瘤中KRAS突變的一致性為76.7％。美國大約10％非小細胞肺癌患者、東亞35％的非小細胞肺癌患者和EGFR有關［13?14］。非小細胞肺癌患者中，EGFR、KRAS和ALK幾乎是單獨起作用的，只要一個突變

代替另一個突變都會影響靶向治療反應。因此，對ctDNA的突變量進行監測可以很好評估腫瘤狀態，反應腫瘤是否發生及發生后的變化情況。

2.3 結直腸癌患者中ctDNA

長期對結直腸癌遺傳改變的觀察發現，在大腸癌患者血清或血漿中都可以檢測到癌基因KRAS、抑癌基因TP53和APC的基因突變［15］。大腸癌患者細胞游離循環DNA中第一個鑒別的遺傳改變是癌基因KRAS的突變。大多數出版的文章都致力于此標記的研究，主要有以下幾個原因：有原癌基因KRAS突變在大腸癌發病率較高（約50％）［16-17］；結直腸癌發生的過程中，甚至是在腺瘤階段，原癌基因KRAS突變是最早的遺傳改變［18］；大約80％的大腸癌患者癌基因表現出KRAS突變的范圍很小，通常在密碼子12，偶爾在密碼子13，少數在第61位密碼子［19-20］。通過等位基因特異性引物定量聚合酶鏈反應技術，對KRAS第2外顯子7個點突變（G12V，G12A，G12D，G12S，G12C，G12R和G13D）和BRAF第15外顯子點突變（V600E）進行分析，結果顯示在KRAS的7個第二外顯子突變和BRAF V600E突變的檢出率分別為92％和100％［21］。對COSM IC數據庫檢索可以發現，這7個最頻繁的KRAS突變占KRAS總突變的90％，BRAF V600E突變占所有BRAF突變的98％。ctDNA中KRAS基因發生突變位點的一致性，更有利于其作為腫瘤的生物標志物。

3 ctDNA檢測技術

ctDNA在血液循環中濃度很低且以碎片化呈現，這是ctDNA檢測的主要挑戰。目前，檢測和分析ctDNA的方法很多，這在楊超等［22］的文章中有較為詳細的介紹。之前大多數方法的靈敏度都偏低，隨著ctDNA的發展和技術的進步，最近出現幾種高靈敏度的檢測方法。標記擴增深度測序（tagged?amplicon deep sequencing，TAM?Seq）、數字聚合酶鏈反應技術（digital PCR）、BEAM ing、焦磷酸活化的聚合反應（pyrophosphorolysis?activated polymerization，PAP）和CAPP?Seq等的出現極大提高了檢測ctDNA的敏感性。使用數字聚合酶鏈反應技術對晚期胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結直腸癌和乳腺癌等的ctDNA檢出率可達75％以上［23］。使用CAPP?Seq方法對非小細胞肺癌設計可檢測多類型外顯子改變，大于95％腫瘤中可以檢測到突變［4］。對于ctDNA在Ⅱ?Ⅳ期的NSCLC患者，敏感性達到100％，Ⅰ期NSCLC患者的敏感性達到50％，該方法檢測EGFR和KRAS中頻率高于0.1％的突變時，檢出率為100％，特異性為99％。由此可見，CAPP?Seq可用于局部晚期或轉移性NSCLC患者的非侵入性腫瘤基因分型。ctDNA的水平與腫瘤體積顯著相關，Ⅱ、Ⅲ期患者在放射治療過程中腫瘤會出現炎癥或纖維化，導致影像學檢查無法正確判斷腫瘤是否存在，而對ctDNA的檢測結果可以判斷腫瘤的狀態。因此，ctDNA水平與臨床預后之間的相關性似乎優于影像學檢查，并提供了快速的反應評估。我們設想，對ctD?NA的檢測可以常規應用于臨床檢測和監測多樣惡性腫瘤，從而便于個體化的癌癥療法。

4 ctDNA的臨床應用

隨著二代基因測序技術的發展，ctDNA檢測技術可以快速和高效地檢測到腫瘤中的基因突變，逐漸成為“液體活檢”的主要手段，其臨床運用包括以下3個方面。

4.1 癌癥早期診斷與癌癥分期

近年來，在影像學檢查結果不明確的情況下，循環生物標志物在評估疾病嚴重程度方面起到重要作用，如CA19?9、CA?125、甲胎蛋白（alphafeto?protein，AFP）和前列腺特異性抗原（prostatic spe?cific antigen，PSA）。然而很多的惡性腫瘤并不具有可靠的蛋白質標記物，即使在有生物標志物的疾病中，也有可能因為缺乏特異性而無法使用。此外，多數的蛋白質生物標志物在血液循環中持續時間較長，可達數周，要準確評估則需要等到數周或數月后。而ctDNA的半衰期短（約2 h），可動態評估癌癥情況。另外，ctDNA的檢測準確性高，且ctDNA水平與腫瘤的大小之間相關程度高，根據ctDNA的突變量的進行監測可以很好評估腫瘤狀態，進行早期診斷和腫瘤分期。

4.2 腫瘤的療效評估

ctDNA可作為安全可靠的療效評估指標。腫瘤患者在臨床治療過程中通常會產生藥物抗性，使得原本有效的藥物失去治療作用，其主要原因可能是基因組成或蛋白調控通路發生改變。例如，原發性結直腸癌患者血漿中的NRAS和KRAS DNA片段原本不存在16號密碼子突變，使用EG?FR阻滯劑治療后，兩者突變頻率顯著升高，患者

可檢出率約46％［23］。研究發現，大約一半肺癌患者對厄洛替尼和吉非替尼不敏感，主要原因是血漿中EGFR的DNA中發生T790M突變［24］。在結直腸癌中對阻斷EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗和帕尼單抗的二次抵抗則與KRAS突變或MET基因擴增有關［25?26］。因此，檢測ctDNA進行基因分析可動態監測藥物的靶向位點是否發生改變，篩選出最佳治療方案，快速有效地在臨床耐藥前采取替代藥物達到精準施藥的效果，避免無效治療并減少藥物產生的副作用。

4.3 復發監測和預后判斷

腫瘤切除后，沒有檢測到ctDNA與沒有腫瘤復發相關聯。此外，各種類型的晚期癌癥都能檢測到ctDNA的存在。2007年，BEAM ing擴增法的開發者美國約翰霍普金斯大學Vogelstein和Kinzler對18名腸癌患者的ctDNA進行了跟蹤。研究顯示，術后仍能檢測到ctDNA的患者，基本上都出現了復發，而術后未檢測到ctDNA的患者，腸癌無復發［27］。該項研究結果表明，ctDNA能展現患者對手術的應答情況。研究者在其他癌癥中得到了類似結果，包括卵巢癌、乳腺癌以及來自其他器官的腫瘤，比如胰臟、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。

與循環腫瘤細胞計數相比，ctDNA在腫瘤特異性突變的預后判斷方面顯示出明顯的優越性［28］。在晚期非小細胞肺癌患者的研究結果表明，在基因突變檢測方面ctDNA顯示出較高的靈敏度，同時在與之相匹配腫瘤的突變狀態檢測方面，ctDNA也顯示出較高的一致性［29］。ctDNA適用于手術后的6～8周進行檢測，以獲得最佳的決策方案［30］。因此，對血漿ctDNA進行檢測可以作為癌癥患者的預后生物標志物，用來分析患者的復發風險。

5 小結

與傳統的組織活檢或固相活檢相比較，液態活檢呈現出巨大的優勢。而在液體活檢中，ctDNA、比其他的腫瘤標記物具有準確性高、半衰期短等優勢。雖然ctDNA與其他標志物相比優勢明顯，但是ctDNA的研究仍處于前期階段，也具有一定的局限性。其一，ctDNA的樣本收集、處理等環節沒有標準化流程，各實驗室之間存在差異；其二，使用ctDNA進行腫瘤分期、臨床轉移和復發預測時，暫時尚無標準的ctDNA標志物及含量的閾值，或矯正曲線；其三，使用NGS進行ctDNA檢測成本較高，進一步改進檢測方法以降低成本顯得尤為重要。

綜上所述，ctDNA檢測技術是一種操作簡便快速、無創、高敏感性和特異性的“液相活檢”技術，使用該技術對ctDNA進行檢測能夠突破腫瘤異質性的限制，可反映腫瘤基因組信息，且有利于掌握血液循環中的特異性突變，進行腫瘤的診斷、療效監測及預后判斷等。因而ctDNA將會越來越多的用于腫瘤的預防以及個體化治療的開展，從而推進精準醫療的實施。

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ctDNA:a specific and sensitive biomarker for human cancers

WU Long1,WANG Suihai2,LIANG Zhikun1★
(1.Guangzhou darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Circulating tumor DNA(ctDNA)is a kind of circulating DNA fragments carrying tumor specific sequence alterations and are found in blood.It can be used as a variety of cancer biomarkers.ctDNA can be detected simply,rapidly,non?invasively,w ith high specificity and sensitivity.The analysis method based on next?generation sequencing(NGS)technologies detecting ctDNA can reflect tumor genom ic informa?tion bymutation status,and plays an important role in research and clinical application of cancer treatment,and treatment decision?making.As a new"liquid biopsy"target,ctDNA has broad application prospects and w ill fa?cilitate the implementation of precise care.This article outlines high frequencymutations in the gene of ctDNA in cancers(breast cancer,lung cancer and colorectal cancer),the latest detection technologies of ctDNA,the good effect of tumor diagnosis,prognosis and efficacy monitoring by detecting ctDNA.It can promote the ap?plication of NGS technologiesby detecting ctDNA in clinicalmedicine.

ctDNA;Next?generation sequencing;Tumor;Liquid biopsy

廣東省科技計劃應用型科技研發專項（2015B020233009）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：梁志坤，E?mail:zhikun_liang@126.com