鎮肝熄風湯對自發性高血壓大鼠促胰液素、生長抑素mRNA表達的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 伍志偉 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋 曹 強 蘇莉莉

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

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·基礎研究·

鎮肝熄風湯對自發性高血壓大鼠促胰液素、生長抑素mRNA表達的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 伍志偉 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋 曹 強 蘇莉莉

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討鎮肝熄風湯對自發性高血壓大鼠(SHR)促胰液素(PZ)、生長抑素(SS)mRNA的影響。方法 14周齡雄性SHR隨機分為模型組(n=15)、貝那普利組(鹽酸貝那普利灌服0.90 mg·kg-1·d-1，n=15)、鎮肝熄風湯低、中、高劑量組(鎮肝熄風湯分別灌服15、30、60 g·kg-1·d-1，n=15)，以WKY大鼠作為正常對照(n=15)，模型組及WKY組每日灌服同體積的蒸餾水。干預8 w后，采用免疫組化法和RT-PCR法檢測十二指腸、胃竇中PZ、SS mRNA的表達。結果 干預8 w后，與WKY組比較，模型組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組與鎮肝熄風湯各劑量組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與貝那普利組比較，鎮肝熄風湯各劑量組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達降低更為明顯(P<0.05)。結論 SHR十二指腸中PZ和胃竇中SS調節失衡，貝那普利和鎮肝熄風湯的降壓作用可能通過調節PZ和SS的表達而達到降壓目的，而鎮肝熄風湯的調節作用更為明顯。

促胰液素；生長抑素；鎮肝熄風湯；貝那普利

自發性高血壓大鼠(SHR)是最接近人類原發性高血壓的動物模型，與人類原發性高血壓病變過程相似，其遺傳穩定均一，而癥狀、體征等隨周齡的增長而發生變化。近年來，胃腸激素與高血壓的關系日益引起廣泛重視〔1，2〕，但胃腸激素通過什么途徑和(或)環節影響血壓的調控仍不明確。

1 材料與方法

1.1 動物 14周齡雄性SHR，SPF級，體重(350±20)g；同源雄性 WKY大鼠15只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗室〔恒溫(22±2)℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h〕。

1.2 實驗分組及干預 SHR常規飼養7 d后，隨機分為模型組、貝那普利組、鎮肝熄風湯高、中、低劑量組，每組各15只；同時以WKY大鼠15只作為WKY組。以蒸餾水為溶劑配制貝那普利和氨氯地平混懸液，貝那普利組灌服貝那普利0.90 mg·kg-1·d-1；中藥低、中、高劑量組分別灌服鎮肝熄風湯 15、30、60 g·kg-1·d-1。SHR組及WKY組每日灌服同等體積的蒸餾水。共干預8 w。

1.3 藥物、試劑和儀器 鎮肝熄風湯按張錫純《醫學衷中參西錄》藥物組成和劑量制備(1兩=30 g，1錢=3 g)，由牛膝30 g、代赭石30 g、龍骨15 g、牡蠣15 g、龜甲15 g、杭白芍15 g、玄參15 g、天冬15 g、川楝子6 g、麥芽6 g、茵陳6 g、甘草4.5 g組成，飲片由甘肅中醫藥大學附屬醫院提供。代赭石、龍骨、牡蠣、龜甲先煎2 h，然后與其他藥物用8倍蒸餾水常規煎煮3次，過濾、濃縮，至含原藥材1.5、3.0 g/ml，置于4℃冰箱中保存，備用。鹽酸貝那普利(洛汀新，10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號：X1936)。促胰液素(PZ)/(Secretin)一抗，批號：GR 80805-1；生長抑素(SS)一抗，批號：GR 80805-1；山羊抗兔IgG(H+L)，ab6702；上述均購于美國Abcam公司。免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司，批號74104)、反轉錄試劑盒(Roche公司)、熒光染料(Roche公司)、PCR引物(金唯智生物科技有限公司設計合成)、全自動酶標分析儀(Bio-Rad公司，型號iMark)、熒光PCR儀(Bio-Rad公司，型號CFX96)、凝膠掃描成像系統(Bio-Rad公司)、電子天平(上海精密科學儀器有限公司，型號FA2004N)、醫用低速離心機(金壇市恒豐儀器廠，型號LX-820)等。

1.4 免疫組化法測定PZ、SSS的表達 取部分十二指腸(幽門下1.5 cm處)、胃竇部組織，作適當的修整后放入4%多聚甲醛中固定。①石蠟切片：40℃過夜，60℃烤片1 h；②常規脫蠟至水；③抗原修復：枸櫞酸緩沖液(pH6.0)恒溫水浴至95℃～98℃，放入玻片，維持60 min；室溫放置自然冷卻，PBS沖洗5 min×3次；④滴加內源性過氧化物酶封閉液，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次；⑤封閉：滴加正常山羊血清，37℃孵育15 min，甩干不洗；⑥滴加稀釋5-HT抗體，然后4℃過夜。用PBS替代一抗作為陰性對照，約12～16 h；次日取出，室溫放置10 min，PBS洗5 min×3次；⑦滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；⑧滴加HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育15 min；PBS洗5 min×3次；⑨DAB顯色：DAB按試劑說明書配置，鏡下觀察，至目的組織出現陽性顆粒而周圍組織無非特異顯色時，蒸餾水終止；⑩蘇木素復染細胞核1～2 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，鏡下控制，自來水反藍10 min；脫水、透明、封片。

1.5 RT-RCR法測定PZ、SS mRNA表達 ①總RNA的提取：取30 mg組織提取總RNA，液氮速凍后碾磨組織，加入600 μl RLT裂解液裂解組織，將所得溶液于離心機4℃、12 000 r/min離心3 min；加入70%乙醇600 μl后，立即轉移700 μl溶液(包括沉淀)至柱子上，4℃ 12 000 r/min離心15 s，完全濾過溶液；分別加入700 μl Buffer RW1、500 μl Buffer RPE，按上述條件離心，棄濾液，加入500 μl Buffer RPE 4℃ 12 000 r/min離心2 min，棄濾液；將柱子移入至新的2 ml試管中，4℃ 12 000 r/min離心1 min干燥濾膜，將柱子移入之新的1.5 ml試管中加入30～50 μl無酶水，4℃ 12 000 r/min離心1 min得到RNA；同時取2 μl RNA樣品稀釋50倍后測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值，OD260/280 1.8～2.0視為提取的總RNA質量純度較好。② 逆轉錄獲得第一鏈cDNA：使用羅氏反轉錄試劑盒(No 0489686-6001)，嚴格按照說明書進行反轉錄總mRNA，合成第一鏈cDNA文庫，反應產物在-20℃冰箱中保存備用，反應條件：25℃、10 min，55℃、30 min，85℃、5 min，4℃保存。引物設計與合成：β-actin：正義：AGGGAAATCGTGCGTGAC，反義：CGCTCATTGCCGATAGTG。③ cDNA的PCR擴增：使用FastStart Universal SYBR Green MASTER(ROX)，實驗步驟參照其說明書，采用總體積50 μl反應體系，反應條件：95℃、5 min，95℃、10 s，55℃、20 s，75℃、30 s。使用PCR儀自帶軟件算出CT值并用2-△△CT法做相對定量分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件，多組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 PZ在十二指腸中的表達 免疫組化檢測結果顯示，PZ在各組大鼠的十二指腸中均有表達。與WKY組(89.59±5.30)比較，模型組PZ的表達(124.51±1.18)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(117.60±1.84)和中藥中、低劑量組PZ的表達(93.60±6.93、113.60±3.47)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥中劑量組PZ的表達顯著降低(P<0.01)中藥高劑量組PZ表達灰度為(122.27±2.51)。鏡下觀察顯示，PZ在黏膜下腺體上皮內分泌細胞的胞質中表達較明顯，由S細胞分泌，WKY組PZ在胞質中表達較弱，模型組PZ在胞質中表達增強，貝那普利組和中藥中、低劑量組PZ在胞質中表達減弱，見圖1。

2.2 SS在胃竇組織中的表達 免疫組化檢測結果顯示，SS在各組大鼠的胃竇中均有表達。與WKY組(78.41±4.16)比較，模型組SS的表達(91.44±2.08)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(82.65±2.99)和中藥高、中劑量組SS的表達(80.39±2.97、88.42±2.37)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥高劑量組SS的表達明顯降低(P<0.05)中藥低劑量組SS表達灰度為91.26±1.97。鏡下觀察顯示，SS由黏膜下腺體上皮內分泌細胞(D細胞)分泌，表達在D細胞質內，散在分布，WKY組SS在D細胞質內表達較弱，模型組SS 在D細胞質內表達增強，貝那普利組和中藥高、中劑量組SS 在D細胞質內表達減弱，見圖2。

2.3 PZ mRNA在十二指腸中的表達 與WKY組(0.10±0.03)比較，模型組PZ mRNA在十二指腸中的表達(1.00±0.07)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(0.55±0.14)和中藥高、中劑量組PZ mRNA(0.19±0.05、0.27±0.02)在十二指腸中的表達降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥高劑量組PZ mRNA在十二指腸中的表達顯著降低(P<0.05)。中藥低劑量組PZ mRNA表達量為1.04±0.13。

圖1 各組大鼠十二指腸中PZ表達(DAB，×400)

2.4 SS mRNA在胃竇中的表達 與WKY組(0.56±0.13)比較，模型組SS mRNA在胃竇中的表達(1.00±0.31)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組SS mRNA在胃竇中的表達降低(P<0.05)，貝那普利組、中藥高、中、低劑量組分別為0.74±0.40，0.25±0.01，0.48±0.24，0.58±0.17；與貝那普利組比較，中藥低劑量組SS mRNA在胃竇中的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

高血壓是目前臨床最常見的慢性疾病之一，是引起心腦血管疾病終點事件的首要危險因素。高血壓的發生與遺傳易感性和環境因素密切相關，遺傳與環境因素可能通過胃腸激素途徑影響血壓的調控。研究認為，血液所攜帶的胃腸激素是胃腸道向腦內傳遞的重要化學信號，這些信號物質可以通過腦干的最后區(AP)直接入腦〔3〕，而部分胃腸激素通過腦干的孤束核將信號傳至下丘腦〔4〕。研究發現SS〔5〕、PZ〔6〕均為應激敏感激素。Welch等〔7〕發現PZ及其受體廣泛分布于大腦皮質和各種神經核團，參與中樞中各種神經元活動的調節，因而他們認為在中樞的PZ充當了神經調質的作用。研究顯示，PZ還可以調節下丘腦、垂體、腎滲透壓〔8，9〕。SS具有調節神經遞質和多種激素的雙重作用〔10〕。Liddle〔11〕研究發現，SS除參與認知、痛覺、行為、胃腸運動等外，還參與血壓的調節。

本實驗結果提示鎮肝熄風湯可能通過下調十二指腸組織中PZ和胃竇組織中SS mRNA的表達，從而起到降壓的作用；并且從生物免疫學角度，發現鎮肝熄風湯不僅能抑制S細胞的分泌功能，使促胰液素在黏膜下腺體上皮內分泌細胞的胞質中表達減弱，進而降低十二指腸組織中PZ的表達；而且能抑制D細胞的內分泌功能，使SS在黏膜下腺體上皮內分泌細胞(D細胞)的胞質中表達減弱，進而降低胃竇組織中SS的表達。從而推測，SHR十二指腸中PZ和胃竇中SS調節失衡，貝那普利和鎮肝熄風湯可能通過調節PZ和SS的表達而達到降壓目的，而鎮肝熄風湯的調節作用更明顯。本次實驗中，中藥高劑量組胃竇組織中SS mRNA表達明顯降低，其機制還需深入研究。

鎮肝熄風湯源自張錫純所著《醫學衷中參西錄》，功以鎮肝熄風，滋陰潛陽。方中牛膝辛行苦降，引血下行，以滋肝腎，故而重用。生赭石質重沉降，重鎮肝氣，使氣血不逆；生龍骨、生牡蠣、生龜板得水之陰，氣厚咸寒，滋陰潛陽，平肝安神，以助君藥，滋潛亢陽；玄參、天冬、白芍其性陰柔，助君制陽，平肝降逆。茵陳、川楝子、麥芽同為佐，清泄肝氣余火，條達肝氣郁結。甘草調和諸藥，麥芍益胃和中，防重墜而護胃，益土而調升降。《顧氏醫鏡》中說：“升降者，病機之要也。”恢復和維持氣機升降出入的有序狀態，使臟腑功能紊亂、氣化失司的無序狀態得以糾正，是疾病治療的目標。脾升清方能補五臟之虛，胃降濁方使六腑傳化有常。因此，疾病治療的關健在于調理中焦，暢達氣機，順脾胃之性而時時顧護胃氣。胃氣存，氣機升降才可能有序；正氣得復，病可向愈〔12〕。有研究認為，鎮肝熄風湯可激活腦組織PPARγ mRNA表達，降低腦組織中ET分泌，使腦血管擴張，從而對SHR產生腦保護作用〔13〕。

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2 祝之明，熊詩強.胃腸道——代謝性高血壓發病的始動器官？見：胡大一，馬長生.心血管病學實踐2015〔M〕.北京：人民衛生出版社，2015：93-8.

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11 Liddle RA.Cholecystokinin：its role in health and disease〔J〕.Curr Opin Endocrinol Diabetes，2003；10(1)：50-4.

12 金 華，張蕾蕾，金 釗.從危重癥胃腸保護看中醫保胃氣的意義〔J〕.醫學與哲學(臨床決策論壇版)，2009；30(12)：37-8.

13 孟云輝，凃 欣，吳艷霞.鎮肝熄風湯對自發性高血壓大鼠腦保護作用的研究〔J〕.北京中醫藥大學學報.2007；30(2)：101-4.

〔2016-04-16修回〕

(編輯 李相軍)

The influence of Zhengan Xifeng decoction on the expression of mRNA of secretin and smatostatin in spontaneously hypertensive rats

JIN Hua,LIU Zhi-Jun,YAN Chun-Lu,et al.

Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Objective To investigate the influence of Zhengan Xifeng decoction on the mRNA expression of Secretin (PZ)and Somatostatin (SS)in spontaneously hypertensive rats (SHR).Methods 45 SHRs(14 week old,male)were randomly assigned into model,Benazepril groups which were given benazepril 0.45 mg·kg-1·d-1and low,middle and high dose of Zhengan xifeng decoction groups (respectively given Zhengan xifeng decoction 15,30,60 g·kg-1·d-1),WKYs as normal control.After 8 weeks of intervention,the expressions of PZ in duodenum and SS in sinuses ventriculi were detected by enzyme linked immunoassay and RT-PCR.Results Compared with those of WKY group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi were significantly decreased(P<0.05).Compared with those of model group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi were increased significantly in Benazepril and Zhengan xifeng decoction groups (P<0.05)after 8 weeks.Compared with those of Benazepril group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi in Zhengan xifeng decoction groups were more significantly (P<0.05).Conclusions The regulation disorder of PZ in duodenum and SS in sinuses ventriculi in the balance exists of SHR.The antihypertensive effect of Benazepril and Zhengan xifeng decoction may be realized by regulating the expression of PZ and SS,while the regulation of Zhengan xifeng decoction was more obvious.

PZ；SS；Zhengan xifeng decoction；Benazepril

國家自然科學基金資助項目(81160477);甘肅省自然科學研究基金計劃( 1107RJZA220);甘肅省高等學校基本科研業務費資助項目(2010-5)

金 華(1970-)，男，教授，主任醫師，主要從事心腦血管疾病及其危險因素的研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)22-5493-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.001