磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α在脂肪變性人肝癌HepG2細胞中的表達及其意義

孔怡琳 張玉佩 楊欽河 鄧遠軍 陳妍凝 梁 曙 梁菊玲

(廣東省中醫院大學城醫院放療科，廣東 廣州 510632)

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磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α在脂肪變性人肝癌HepG2細胞中的表達及其意義

孔怡琳 張玉佩1楊欽河1鄧遠軍1陳妍凝1梁 曙1梁菊玲1

(廣東省中醫院大學城醫院放療科，廣東 廣州 510632)

目的 觀察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α磷酸化在HepG2細胞脂變模型中的表達及意義。方法 HepG2細胞予油酸和棕櫚酸組成的0.3 mmol/L游離脂肪酸(FFA)誘導24 h后，建立脂肪變性HepG2細胞模型，并設置對照組比較。誘導成功后，采用油紅O染色觀察細胞內脂滴蓄積狀態；采用全自動生化儀檢測細胞上清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量和細胞內甘油三酯(TG)含量；采用生物試劑盒檢測細胞內超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化，運用Western印跡法檢測各組細胞AMPKα和磷酸化AMPKα(pAMPKα)蛋白的表達。結果 與對照組比較，模型組細胞內橘紅色脂滴大量形成，且細胞內TG和MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD含量水平明顯下降(P<0.01)，pAMPKα蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。結論 FFA誘導的脂肪變性HepG2細胞模型可以出現脂質代謝紊亂和氧化應激狀態，其機制可能與細胞內pAMPKα蛋白的激活減少有關。

脂肪變性；氧化應激；腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α被稱為“能量感受器”，是真核細胞內與細胞能量代謝有關的蛋白激酶，與腫瘤和糖脂代謝紊亂型疾病等關系密切〔1，2〕。研究表明，AMPK可以感受細胞能量代謝的變化來調節脂肪酸和葡萄糖的代謝過程，并以磷酸化的形式抑制脂肪酸合成和增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化〔3〕。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以無過量飲酒史和肝細胞彌漫性脂肪病變為主要特征，并體現遺傳-環境-代謝應激特點的一類臨床病理綜合征。研究表明，AMPK/沉默調節因子1(SIRT1)通路參與了體內脂肪酸、葡萄糖的合成、代謝和輸出，是NAFLD發病的關鍵環節之一〔4〕。國內外研究表明，人肝癌HepG2細胞與肝細胞在生物學特點和功能上存在相似性，油酸和棕櫚酸等誘導劑都可以促使肝細胞和HepG2細胞發生脂肪變性，相比而言，HepG2細胞對脂毒性的耐受力更強，是脂肪變性細胞模型中最具優勢和前景的備選細胞之一〔5，6〕。本研究通過游離脂肪酸(FFA)建立一種人肝癌HepG2細胞脂變模型，觀察AMPK磷酸化(pAMPK)在脂肪變性HepG2細胞中的表達及其與脂質代謝、氧化應激的內在關系，以期從細胞水平探討NAFLD的發病機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞株由暨南大學醫學院生化教研室饋贈；胎牛血清、DMEM高糖培養基和0.25%胰蛋白酶購自美國hyclone公司；油酸、棕櫚酸和無游離脂肪酸牛血清白蛋白(FFA-free BSA)購自美國sigma公司；油紅O染色試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度試劑盒購自中國碧云天生物技術研究所；兔抗鼠AMPKα多克隆抗體、兔抗鼠pAMPKα多克隆抗體、內參照GAPDH蛋白抗體購自美國Cell Signaling公司。7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)，倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，JY96-Ⅱ型超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，Tecan-safire2型全波長多功能酶標儀(奧地利TECAN公司)，蛋白垂直電泳及轉印系統(美國Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細胞常規培養 HepG2細胞常規培養于含10%胎牛血清DMEM高糖培養基中，培養條件為37℃，CO2濃度為5%。根據細胞生長情況，待細胞長至瓶壁80%～90%(約每2～3 d)，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞并傳代。

1.2.2 脂肪變性HepG2細胞模型的誘導 參考Gómez-lechón等〔5〕方法并進行改進，將終濃度為2 mmol/L的油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)，以2∶1的比例混合配制成儲液，再將脂肪酸儲液與FFA-free BSA混合，配制成結合BSA的脂肪酸。將處于對數生長期的HepG2細胞接種于6孔培養板中，在37℃、5%CO2培養箱中孵育貼壁48 h后更換新鮮培養液，設立模型組和對照組，每組6復孔，將含0.3 mmol/L的FFA無血清DMEM培養基加入模型組培養孔中孵育細胞24 h，對照組為加入含1%FFA-free BSA無血清的DMEM培養基，孵育細胞24 h。

1.2.3 油紅O染色觀察細胞內脂質蓄積的程度 模型誘導成功后，吸棄各組細胞培養孔中的培養基，用PBS洗滌3遍，將6孔板中的細胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，油紅O染液閉光染色20 min，60%異丙醇沖洗30 s，蒸餾水洗30 s至背景透明，OTC明膠封片，放置于顯微鏡下，采用Leica Qwin plus系統(普通光)拍照，觀察各組細胞內脂質蓄積的程度。

1.2.4 全自動生化儀檢測細胞上清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量變化 細胞誘導24 h成功后，將各培養孔中的細胞上清分別加進對應1.5 ml EP管中，樣本送到暨南大學第一附屬醫院生化檢驗科，采用全自動生化儀檢測細胞培養上清中ALT、AST含量變化。

1.2.5 全自動生化儀檢測細胞內甘油三酯(TG)含量 取完各孔細胞上清后，將細胞用PBS洗滌2遍，加入0.25%胰酶消化細胞，用含10%胎牛血清DMEM培養基終止消化，并吹打細胞，確保將各孔內的所有細胞吹下，將各孔中的細胞懸液分別移入1.5 ml EP管中，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；PBS洗滌細胞2遍，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；將EP管置于冰上，每管各加入異丙醇300 μl；用超聲細胞粉碎機裂解細胞3 min；細胞破碎后，離心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，樣本送到暨南大學第一附屬醫院生化檢驗科，采用全自動生化儀檢測上清中TG的含量。

1.2.6 生物試劑盒檢測細胞內SOD、MDA的含量 按1.2.4方法處理細胞后，取細胞裂解液，采用SOD測定試劑盒(水溶性四唑鹽法)和MDA測定試劑盒(硫代巴比妥酸法)，按照說明書檢測細胞內SOD和MDA含量變化。

1.2.7 Western印跡法檢測細胞AMPKα、pAMPKα蛋白表達水平 按1.2.4方法處理細胞后取適量細胞裂解液，使用前加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF終濃度為1 mmol/L。并對各組細胞進行計數，按照每6×106個細胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min離心5 min，根據碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說明書對蛋白含量進行測定。HepG2細胞樣本進行凝膠電泳、轉膜、封閉和一抗孵育，并在4℃下過夜，然后洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后于暗室曝光，在X光片上顯影，用Quantity One 軟件對各條帶的吸光度值進行分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 油紅O染色觀察各組細胞內脂質蓄積程度 對照組細胞輪廓及邊緣清晰，體積較小，大部分細胞內無顯著橘紅色脂滴蓄積，偶見少數細胞內有少量橘紅色脂滴，顏色較淡；模型組細胞胞膜輪廓及邊緣模糊，體積明顯腫大，細胞內可見較多橘紅色脂滴，并出現脂滴融合的現象，部分脂滴甚至融合成鏈狀或環狀，見圖1。

2.2 各組細胞AMPKα、pAMPKα蛋白表達水平 與對照組(AMPKα:0.93±0.15,pAMPKα:0.81±0.12)比較，模型組AMPKα總蛋白表達(0.77±0.09)輕度下調，差異無統計學意義(P>0.05)，而pAMPKα蛋白表達(0.37±0.1)顯著下調(P<0.01)，見圖2。

圖1 油紅O染色觀察各組細胞內脂質蓄積程度(×200)

圖2 各組細胞AMPKα 和 pAMPKα蛋白的表達

2.3 各組細胞上清ALT、AST含量變化 與對照組〔ALT(3.2±0.46)、AST(9.13±0.59)U/L〕比較，模型組誘導24 h后，細胞上清中的ALT〔(3.42±0.54)U/L〕、AST含量〔(10.57±2.19)U/L〕輕度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，提示采用0.3 mmol/L的FFA誘導HepG2細胞脂肪變性的方法，雖然會引起ALT、AST含量輕度上升，但對細胞的損傷程度有限。

2.4 各組細胞內TG含量的變化 與對照組〔(0.21±0.03)mmol/L〕比較，模型組HepG2細胞內TG含量〔(0.3±0.42)mmol/L〕明顯增高(n=6，P<0.01)，提示FFA誘導HepG2細胞發生脂肪變性后會有大量的脂肪在細胞內蓄積。

2.5 各組細胞內SOD、MDA含量的變化 與對照組〔SOD(111.25±9.6)U/ngprot,MDA(13.04±2.68)nmol/mgprot〕比較，模型組細胞SOD含量〔(63.89±9.28)U/mgprot〕明顯下降(P<0.01)，MDA含量〔(29.2±3.38)nmol/mgprot〕明顯增高(P<0.01)。

3 討 論

NAFLD在西方人群中發病率為20%～30%，在我國發病率為5%～24%，是僅次于病毒性肝炎的慢性肝病之一，且呈低齡化的發病趨勢〔7～9〕，因此開展對NAFLD的防治研究具有重要的現實意義。體外脂肪變性細胞模型作為與NAFLD動物模型互補的研究載體，具有培養環境相對穩定、不受體內神經內分泌因素的干擾、實驗條件易于控制和實驗周期較短等有利優勢，是研究NAFLD發病機制的重要技術平臺。本實驗以人肝癌HepG2細胞為研究對象，采用0.3 mmol/L的FFA無血清DMEM培養基誘導細胞建立脂肪變性HepG2細胞模型成功，該模型脂毒性較小，結合以往的研究成果分析，可能與細胞對高營養物質攝入增加，大量的FFA進入肝細胞內超過肝細胞的氧化能力，引起細胞脂質代謝障礙，TG的合成增多，TG的轉運和氧化功能出現障礙所致〔10～12〕。目前闡釋NAFLD發病進程的“二次打擊”學說認為氧化應激、脂質過氧化、線粒體功能障礙及炎性細胞因子的釋放等因素是單純性脂肪肝向脂肪性肝炎進展的關鍵因素，其進程可導致肝細胞膜損害，肝細胞發生脂肪變性、壞死、炎性浸潤及活性氧(ROS)、MDA等代謝產物增多〔13〕。ROS不僅使細胞內抗氧化物質大量消耗，使微粒體脂質過氧化反應增強，導致氧化與抗氧化失衡，引起肝細胞損害加重，線粒體呼吸鏈功能下降，ATP合成障礙，還促使脂質過氧化產物MDA增多，而清除氧自由基的SOD大量減少〔14～16〕。MDA是脂質過氧化的最終產物，其含量高低反映了脂質過氧化的程度；SOD是高效的清道夫，可抑制氧自由基啟動的脂質過氧化〔17〕。本研究結果提示脂質過氧化參與了細胞脂肪變性的過程，FFA誘導HepG2細胞發生脂肪變性24 h后，細胞內可以出現氧化應激的狀態，其致病特點與NAFLD的發病機制存在相似性，是一種穩定、有效、更接近于NAFLD發病進程的體外細胞模型，為未來探索NAFLD的發病機制和篩選抗NAFLD藥物提供了有利的技術平臺。AMPK 在肝臟脂質穩態調節和能量平衡中發揮重要作用，其機制是通過對代謝酶的快速直接修飾(磷酸化)實現的，包括 AMPKα 亞單位的蘇氨酸 172 位點發生磷酸化，AMPK 可以被激活為有活性的 pAMPK 形式，進而通過調節下游蛋白激酶或調控各種基因表達而影響機體的能量代謝〔18〕。研究表明，AMPK既可以下調固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP1c)的表達抑制脂肪合成，又可以上調過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的表達促進脂肪分解，全面參與體內脂肪的合成和分解代謝〔19〕。本研究結果表明FFA誘導的脂肪變性HepG2細胞模型發生的脂質代謝紊亂和氧化應激狀態，其機制可能與細胞內pAMPKα蛋白激活減少有關。由此可見，pAMPKα是參與機體脂質代謝調節的關鍵環節，pAMPKα可能成為防治NAFLD新的藥物靶點。

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〔2016-03-08修回〕

(編輯 李相軍)

The expression and significance of AMPKα phosphorylation in the HepG2 cell model of steatosis

KONG Yi-Lin，ZHANG Yu-Pei，YANG Qin-He，et al.

Department of Radiology,University City Hospital of Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Objective To establish a steatotic HepG2 cell model induced by free fatty acid(FFA),and observe the expression and significance of adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase α(AMPKα)phosphorylation in HepG2 cells of steatosis.Methods Induced with DMEM medium of 0.3 mmol/L FFA(composed of oleic acid and palmitic acid)for 24 hours,the steatotic HepG2 cell model was successfully established(control group).After the cell models were successfully established,lipid droplets in cytoplasm were observed with Oil Red O staining,while the levels of alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST)in serum,and triglyceride (TG)accumulation in HepG2 cells were measured by automatic biochemical analyzer.The activities of superoxide dismutase(SOD)and malonyldialdehyde(MDA)were tested by biological reagent kit,while the protein expression of AMPKα and pAMPKα were analyzed by Western blot.Results Compared with those of control group,the levels of TG and MDA content were significantly higher (P<0.01),and lots of red lipid droplets inside cytoplasm were visible,while the expression of pAMPKα protein and SOD levels were significantly reduced (P<0.01)in model group.Conclusions The FFA-induced steatosis in HepG2 cells may result in lipid metabolism disorder and oxidative stress,possibly by activating the pAMPKα protein mildly in HepG2 cells.

Steatosis；Oxidative stress；AMPKα；Phosphorylation

國家自然科學基金資助項目(81302878)；廣東省中醫藥局項目(20151224，20152112);廣東省醫學科研基金項目(A2015521)

張玉佩(1982-)，男，碩士，實驗師，主要從事中西醫結合防治慢性肝病及脂代謝疾病研究。

孔怡琳(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合防治腫瘤及慢性肝病的基礎與臨床研究。

Q493.5

A

1005-9202(2016)22-5496-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.002

1 暨南大學醫學院