S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白在原發性腦干損傷后的表達

張麗勇 曹紅十

(白城醫學高等專科學校生理教研室，吉林 白城 137000)

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S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白在原發性腦干損傷后的表達

張麗勇 曹紅十1

(白城醫學高等專科學校生理教研室，吉林 白城 137000)

目的 探討原發性腦干損傷后腦干組織中S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白的表達規律。方法 56只SD大鼠中隨機取7只作對照組，其余49只采用機械撞擊法建立大鼠原發性腦干損傷模型，7只大鼠擊打30 min內死亡，記為擊打后30 min組；存活的42只大鼠隨機分為6組，每組7只，分別于擊打后2、6、12、24、48、72 h斷髓處死。采用Gless嗜銀染色，SP免疫組化法觀察并測定不同損傷時間大鼠腦干組織中S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白表達情況。結果 S100B蛋白表達量從腦干損傷后30 min開始增加，隨時間延伸逐漸升高，損傷后24 h達到峰值并開始下降，損傷后72 h基本恢復至正常水平并與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。膠質纖維酸性蛋白量從腦干損傷后30 min開始增加，損傷后48 h達到峰值并開始下降，但損傷后72 h仍高于對照組(P<0.05)。結論 原發性腦干損傷后S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白表達具有明顯規律性，在起病時間的推斷和神經修復過程中具有重要意義。

腦干損傷；S100B蛋白；膠質纖維酸性蛋白

腦損傷后中樞神經系統中星形膠質細胞常出現增生，這是退行性病變及中樞神經損傷引發神經組織變化的主要表現。S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白是兩種主要的神經膠質細胞標記蛋白〔1〕，研究其在腦干損傷后不同時間的變化規律有助于較精準地推斷原發性腦干損傷患者的發病時間，采取有針對性的治療方案從而改善預后。本次研究通過檢測損傷后不同時間段大鼠腦干組織中S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白的表達情況，分析其在原發性腦干損傷中的作用機制及變化規律。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 SPF級SD大鼠56只，體質量(200±20)g，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。SP免疫組化檢測試劑盒、兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購于上海研卉生物科技有限公司；大鼠抗S100B蛋白多克隆抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司。

1.2 模型建立及分組 隨機取7只大鼠作對照組，其余49只大鼠建立原發性腦干損傷模型。撞擊裝置為自行設計，在鐵支架上固定一根內徑為1.5 cm的光滑導管，支架底座固定一木板，前端垂直放置一個小擋板，調整導管角度使其與底座之間呈45°夾角。大鼠按300 mg/kg腹腔注射100 g/L的水合氯醛麻醉，清除頭顱表面皮毛后暴露顱骨，大鼠在底座上取俯臥位，將導管對準枕骨粗隆段，擊打裝置從導管遠端自由下滑對枕部進行打擊，每只大鼠擊打1次，造成原發性腦干損傷。7只大鼠擊打30 min內死亡，記為擊打后30 min組；存活的42只大鼠采用隨機數字法分為6組，每組7只，分別于擊打后2、6、12、24、48、72 h斷髓處死；對照組大鼠直接斷髓處死。

1.3 標本采集和檢測 大鼠處死后立即開顱取腦干組織，在4%多聚甲醛溶液中固定1 d。沿正中線將腦干組織切開，將橫切面作為包埋面常規組織脫水，石蠟包埋后3 μm連續切片，分別行Gless嗜銀染色和免疫組化染色。使用Motic數字切片掃描與應用系統，顯微鏡放大400倍，隨機取7個視野，對免疫組化陽性細胞進一步測定S100B蛋白、膠質纖維酸性蛋白表達的灰度值。

1.4 統計學分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠臨床癥狀觀察 實驗組大鼠受打擊后即刻出現昏迷、呼吸急促、角膜反射消失等體征。擊打后30 min組大鼠在受打擊后出現心律不齊、呼吸不規律，20～30 min心臟搏動停止。傷后存活大鼠在受打擊后15～20 min呼吸和心臟搏動基本恢復到正常水平，約60 min后蘇醒，生命體征平穩。腦干損傷大鼠均可見腦干水腫，明顯的蛛網膜下腔出血，后30 min組出血部位較多。

2.2 Gless嗜銀染色 對照組大鼠腦干組織軸索走行、排列規律，間隙均勻分布。擊打后30 min組大鼠呈彌散性分布的軸索扭曲、腫脹，間隙寬度明顯增加、末端腫大。擊打后2、6 h組大鼠腦干中以軸索扭曲、腫脹為主要特征的變化更明顯；擊打后12 h組大鼠可見軸漿從軸索中流出，進入腦干組織局部產生的軸索收索球，見圖1；擊打后24 h大鼠腦干組織中可見軸索收索球體積和數量增加；擊打后48、72 h組大鼠腦干組織中軸索腫脹程度明顯減輕。

圖1 大鼠腦干損傷12 h后形成的軸索收索球(Gless嗜銀染色，×400)

2.3 各組S100B蛋白表達情況 對照組大鼠神經膠質細胞突起和胞體中均勻分布S100B陽性細胞；S100B蛋白表達量為79.93±0.82。擊打后30 min組大鼠細胞結構破壞，突起消失；S100B蛋白表達量為85.04±0.76，明顯高于對照組(P<0.01)。之后大鼠腦干組織S100B蛋白表達隨著擊打后時間的延伸逐漸升高，于擊打后24 h達到峰值98.53±0.81，明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后48 h大鼠腦干組織S100B蛋白表達量87.84±1.07，與擊打后24 h相比有所降低，但仍明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后72 h大鼠腦干組織S100B蛋白表達量80.03±0.95，與對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，細胞體積逐漸增大到正常范圍，可見細胞核。見圖2。

2.4 各組膠質纖維酸性蛋白表達情況 對照組大鼠神經膠質細胞突起和胞體中分布膠質纖維酸性蛋白陽性細胞，胞體較小，突起細長，膠質纖維酸性蛋白表達量為31.62±0.57。擊打后30 min組大鼠部分細胞形態不規則，見圖3，膠質纖維酸性蛋白表達量為36.11±0.54，明顯高于對照組(P<0.01)。擊打后2 h組大鼠細胞突起染色加深，膠質纖維酸性蛋白表達量為37.94±0.68，明顯高于對照組(P<0.01)。隨時間延長其表達量逐漸上升，擊打后48 h達到峰值47.30±0.65，明顯高于對照組(P<0.01)，細胞形態不規則，胞質顏色加深，突起增多。擊打后72 h膠質纖維酸性蛋白表達量為45.73±0.39，仍明顯高于對照組(P<0.05)。

圖2 大鼠腦干組織中S100B蛋白表達情況(DAB，×400)

圖3 大鼠腦干組織中膠質纖維酸性蛋白表達情況(DAB，×400)

3 討 論

中樞神經系統中星形膠質細胞是數量最多的支持細胞，在日常神經生理活動、神經組織再生及免疫、多種神經疾病的發病中發揮重要作用〔2〕。S100B是一類低分子量的鈣離子結合蛋白，主要由星形膠質細胞、少突膠質細胞分泌，具有多種活性，可作為星形膠質細胞激活的重要標志物，能夠提升神經膠質細胞和神經元中Ca2+濃度〔3〕。相關研究顯示，S100B蛋白可經類似旁分泌作用促進神經生長；在損傷反應中表達量明顯提升，與損失時間及程度呈相關性〔4〕。膠質纖維酸性蛋白是一種中間絲狀蛋白，由星形膠質細胞特異性表達，可作為星形膠質細胞和其癌變的特異性標志物〔5〕。細胞數量、體積及分支增加，膠質纖維酸性蛋白表達提升是星形膠質細胞反應的標志〔6〕，因此其增殖水平及腦干損傷后病變程度能夠用膠質纖維酸性蛋白表達水平來評價。

本研究顯示，大鼠腦干損傷后30 min內，S100B蛋白與膠質纖維酸性蛋白表達量開始增加，此時表達量增加可能為星形膠質細胞反應性肥大而非增生，撞擊損傷了大鼠腦干神經的星狀膠質細胞結構，S100B蛋白與膠質纖維酸性蛋白從胞內漏出而導致表達量上升。隨著時間延伸，腦干損傷反應程度不斷提升，到24～48 h達到損傷反應的峰值，之后神經膠質細胞自我修復和再生能力不斷加強，相應的損傷反應逐漸減弱，S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白的表達量下降，直至修復完成。綜上所述，原發性腦干損傷后S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白表達隨時間呈明顯變化規律，以上兩項指標聯合分析有助于判斷患者腦干損傷較為精確的時間，采取有針對性的治療方案，改善治療預后。

1 Yan H，Zhang HW，Wu QL,etal.Increased leakage of brain antigens after traumatic brain injury and effect of immune tolerance induced by cells on traumatic brain injury〔J〕.Chin Med J，2012；125(9)：1618-26.

2 劉 濤，何曉光，劉佰運，等.326例急性閉合性重型顱腦創傷早期死亡分析〔J〕.中華神經外科雜志，2010；26(8)：731-3.

3 Cheng TY，Chen MH，Chang WH，etal.Neural stem cells encapsulated in a functionalized self-assembling peptide hydrogel for brain tissue engineering〔J〕.Biomaterials，2013；34(8)：2005-16.

4 Guan J，Zhu Z，Zhao RC，etal.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats〔J〕.Biomaterials，2013；34(24)：5937-46.

5 黃效東.奧拉西坦治療老年重型顱腦損傷患者的療效〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(10)：2159-60.

6 Kanoto M，Hosoya T，Toyoguchi Y，etal.Brain stem and cerebellar atrophy in chronic progressive neuro-Behet's disease〔J〕.Eur J Radiol，2013；82(1)：146-50.

〔2016-04-18修回〕

(編輯 郭 菁)

吉林省教育廳“十二五”科技研究項目(2013336)

曹紅十(1977-)，女，副主任護師，主要從事臨床護理藥理學研究。

張麗勇(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事臨床生理學研究。

R651.1

A

1005-9202(2016)22-5504-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.005

1 吉林大學第一醫院