PNU上調大鼠皮質星形膠質細胞內源性Cryab抑制Aβ聚集

任真奎 楊 梅 官志忠 禹文峰

(貴州醫科大學醫學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

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PNU上調大鼠皮質星形膠質細胞內源性Cryab抑制Aβ聚集

任真奎 楊 梅 官志忠 禹文峰

(貴州醫科大學醫學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 探討PNU激活星形膠質細胞α7膽堿能受體(α7 nAChRs)上調內源性B-晶狀體蛋白(Cryab)并抑制β淀粉樣蛋白(Aβ)集聚的現象及其機制。方法 分離24 h內新生乳鼠大腦皮質培養原代星形膠質細胞并鑒定；體外制備Aβ1～42寡聚體；將細胞分為對照組、PNU組、PNU+α7 nAChRs阻斷劑(MLA)組、Aβ1～42組、PNU+ Aβ1～42組、PI3K信號通路阻斷劑LY294002+PNU+ Aβ1～42組。用蛋白印跡法檢測細胞內Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚體的表達水平。結果 (1)PNU可以顯著上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白(P<0.05)；應用MLA阻斷α7 nAChRs后，PNU上調內源性Cryab蛋白的作用被顯著抑制(P<0.05)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU上調內源性Cryab蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；(2)PNU能夠顯著上調磷酸化Akt蛋白水平(P<0.05)；應用MLA阻斷α7 nAChRs后，PNU上調磷酸化Akt蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU上調磷酸化Akt蛋白的作用被顯著抑制(P<0.01)；(3)在細胞裂解液及培養基中，PNU顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用(P<0.01)；使用LY294002阻斷PI3K信號通路后，PNU增強星形膠質細胞抑制Aβ聚集的功能顯著減弱(P<0.01)。結論 PNU通過激活星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab從而抑制Aβ集聚；PI3K/Akt信號通路可能參與PNU激活星形膠質細胞α7 nAChRs上調內源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的過程。

星形膠質細胞；阿爾茨海默??；α7膽堿能受體；PNU；B-晶狀體蛋白；β淀粉樣蛋白

β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集是阿爾茨海默病(AD)核心發病機制，Aβ的聚集不僅可以導致神經細胞凋亡，也可以破壞突觸結構和功能，從而導致記憶和認知功能障礙〔1〕。Aβ的聚集能夠激活星形膠質細胞釋放細胞因子、炎性因子從而導致腦內的神經炎癥〔2〕。

α7膽堿能受體(α7 nAChRs)廣泛分布于大腦皮質和海馬的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞〔3〕。在 AD 的發病機制中，α7 nAChRs通過與Aβ相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經毒性的一個重要靶點〔5〕。B-晶狀體蛋白(Cryab)在大腦內具有許多重要的生理功能：抗炎、抗凋亡和神經保護等〔6〕。在AD大腦中，星形膠質細胞表達的Cryab蛋白明顯上調，并且這些上調的Cryab蛋白緊密地分布在Aβ蛋白沉積周圍〔7〕。Cryab蛋白能夠通過與Aβ蛋白直接結合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其細胞毒性作用〔8〕。

PNU是α7 nAchR激動劑中特異性較高的合成物，與其他nAchR亞單位結合微乎其微，與α7 nAChR結合，提高和改善AD動物模型的認知和記憶功能〔9〕。PNU通過激活星形膠質細胞α7 nAChR提高細胞的存活與抗凋亡〔10〕，但在星形膠質細胞模型中，PNU是否能增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制及其機制尚不清楚。

我們前期研究結果證實，用PNU激活星形膠質細胞a7 nAChRs能夠顯著增強星形膠質細胞對 Aβ聚集的抑制，但具體調控機制不清楚。基于Cryab蛋白的特性，推測星形膠質細胞內源性Cryab蛋白可能是PNU介導Aβ聚集的中間環節。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 胎牛血清及DMEM培養基購于Gibco公司(美國)；Aβ1～42肽、六氟異丙醇、二甲基亞砜(DMSO)、PNU、methyllycaconitine (MLA) 購于Sigma公司(美國)；青-鏈霉素及胰蛋白酶購于Hyclone公司(美國)；6E10抗體購自BioLegend公司(美國)；鼠抗Cryab(αB-crystallin)單克隆抗體購自Abcam公司(美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin) 單克隆抗體；磷脂酰肌醇子-激酶- 蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的抑制劑LY294002及相關位點的抗體購于CST公司(美國)；抗體稀釋液、封閉液、聚丙烯酰胺凝膠購自碧云天公司；高效顯影膠片、顯影液、定影液購自柯達公司；電化學增強發生法(ECL-Plus)試劑及聚乙烯二氟(PVDF)膜購于Millipore公司(美國)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司(美國)；倒置顯微鏡(Olympus)；-80℃冰箱(美國Thermo公司)；高速離心機(德國Eppendorf公司)；ELX 800酶標儀 (美國 Bio-tec公司)；CO2培養箱(日本SANYO公司)。

1.2 Aβ1～42寡聚體的制備 參照Klein〔11〕體外制備Aβ1～42寡聚體的方法，將預冷的六氟異丙醇(HFIP)加入Aβ1～42粉末中，使其充分溶解后常溫孵育60 min。隨后為使HFIP揮發完全，將其放在常溫下通風櫥過夜。將干燥的肽膜于-80℃保存，使用時取出用DMSO溶解，再用含十二烷基硫酸鈉(SDS)的硝酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，4℃存放2 w，冰凍高速離心(10 min、14 000 g/min)，上清液即為寡聚體。

1.3 星形膠質細胞培養傳代及鑒定 參照McCarthy等〔12,13〕的方法并改進，取24～48 h內新生SD乳鼠的大腦皮質(貴州醫科大學動物實驗中心提供)，動物合格證號：SCXK(黔)2012-0001，將其大腦皮質剪成泥狀，消化漂洗后，加入含1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)、10%FBS的高糖DMEM培養基，吹打成細胞懸液，接種至培養瓶，5%二氧化碳、37℃恒溫培養。24 h后換液，之后每3天換1次液直至細胞鋪滿瓶底。培養8～9 d，純化并傳3～4代。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)細胞免疫熒光法對星形膠質細胞進行染色，鑒定細胞純度。

1.4 分組及細胞處理 將培養好的星形膠質細胞純化、傳代并鑒定后，以5×105的密度種入六孔板內。將細胞分為對照組、PNU組、PNU+MLA組、Aβ1～42組、PNU+ Aβ1～42組、PNU+ LY294002+ Aβ1～42組。PNU+MLA組預先加入MLA處理2 h，隨后加入PNU；PNU+ LY294002+ Aβ1～42組，預先加入LY294002處理2 h，隨后加入PNU孵育18 h，換液后，用DMEM培養基吹洗3次，加入終濃度為1 μmol/L的Aβ1～42寡聚體繼續在37℃ 、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.5 蛋白印跡法 從六孔板中收集細胞，加入細胞裂解液(100 μl/孔)，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清，將提取的蛋白質用BCA蛋白定量試劑盒定量后分裝保存(-80℃)，用Western印跡方法檢測Cryab、P-Akt(ser473)及Aβ蛋白表達水平。12%的梯度膠電泳，蛋白樣品分離后轉移至PVDF膜，5%胎牛血清(BSA)室溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)漂洗(3次×10 min)，加入相應一抗，4℃孵育過夜，TBS-T漂洗(3次×10 min)后加入HRP標記二抗室溫孵育1 h，TBS-T漂洗(3次×10 min)后曝光。用ImageJ軟件分析曝光結果，以β-actin為內對照。

1.6 統計學方法 應用SPSS22.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用one-way ANOVA分析。

2 結 果

2.1 PNU顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用 在原代星形膠質細胞培養模型上，用α7 nAChRs 激動劑PNU處理細胞，能夠顯著增加星形膠質細胞對細胞內(Aβ1～42組86.22±8.56，PNU+Aβ1～42組53.13±11.56)和細胞培養液內(Aβ1～42組100.74±3.98，PNU+Aβ1～42組54.63±13.58)Aβ聚集的抑制作用,見圖1。

圖1 PNU增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用

2.2 PNU顯著上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白表達水平 課題組前期結果顯示，PNU以5 μmol/L刺激星形膠質細胞后對Cryab蛋白的上調作用最為明顯。以5 μmol/L PNU處理星形膠質細胞在不同的時間段(6，12，18，24 h)，對Cryab蛋白的上調效應表現出時間依賴性，0、6、12、18、24 h Cryab蛋白表達量分別為102.71±13.08，223.99±25.32，336.57±60.78，427.32±26.73，340.65±55.40，18 h達到穩定階段，選擇該時間、濃度(18 h、5 μmol/L)作為后繼研究。PNU刺激后 Cryab的表達量升高。見圖2。

2.3 PNU通過激活α7 nAChRs而上調Cryab蛋白水平 PNU刺激星形膠質細胞后α7nAChRs的表達上調。本研究選取α7nAChRs的特異性阻斷劑 MLA，以50、100、150 nmol/L MLA預先處理星形膠質細胞2 h后，再加入5 μmol/L PNU共同孵育18 h。不加PNU、MLA時Cryab蛋白表達量為95.54±9.14；加PNU 5 μmol/L及0、50、100、150 nmol/L MLA后Cryab蛋白表達量依次為128.92±15.65，81.01±20.15，75.71±3.03，84.28±6.63。MLA刺激星形膠質細胞后PNU上調內源性 Cryab的效應受到抑制。見圖3。

圖2 PNU上調內源性Cryab蛋白

圖3 PNU通過激活α7 nAChRs而上調內源性Cryab蛋白

2.4 PI3K/Akt信號通路參與PNU激活α7 nAChRs上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白 不加PNU，P-Akt蛋白表達量為93.67±3.84。以5 μmol/L PNU處理星形膠質細胞在不同時間段(5，10，20，30 min)，對P-Akt(ser473)蛋白的上調效應表現出時間依賴性并且20 min達到穩定階段，0、10、20、30 min時P-Akt蛋白表達量分別為110.66±9.80，97.55±17.93，132.98±13.23，138.40±24.292 0 min被選擇作為后繼實驗。該上調作用被PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002或α7 nAChRs的阻斷劑MLA抑制。不加PNU、LY294002時，P-Akt表達量為98.08±5.61，僅加PNU 5 μmol/L時P-Akt表達量為143.99±6.64，PNU及LY294002共同作用時，P-Akt表達量為57.85±8.930。不加PNU、MLA時，P-Akt表達量為98.10±6.34，僅加PNU時，P-Akt表達量為144.03±14.53；PNU及MLA共同作用時，P-Akt表達量為75.20±12.96。見圖4，圖5。

不加PNU、LY294002時，Cyab表達量為91.72±7.27；僅予PNU時為Cryab表達量為134.29±20.74，LY294002預先處理星形膠質細胞2 h，再加入PNU共同孵育18 h，星形膠質細胞內源性Cryab的表達受到抑制(93.40±16.30)。見圖6。

圖4 PNU上調P-Akt(ser473)蛋白表達

圖5 LY294002或MLA能抑制P-Akt(ser473)蛋白表達

圖6 LY294002能抑制內源性Cryab蛋白表達

2.5 PNU顯著增強星形膠質細胞對Aβ聚集的抑制作用與PI3K/Akt信號通路的激活相關 與Aβ1～42組相比，PNU+ Aβ1～42組的Aβ蛋白顯著下調(P<0.01)；與PNU+ Aβ1～42組相比，PNU+ Aβ1～42+ LY294002組的Aβ蛋白顯著上調(P<0.01)。說明PNU激活α7 nAChRs之后，通過PI3K/Akt信號通路上調Cryab，從而抑制Aβ的集聚。見表1，圖7。

表1 LY294002處理星形膠質細胞后Aβ寡聚體表達的檢測

與Aβ1～42組相比:1)P<0.01；與PNU+ Aβ1～42組相比:2)P<0.01

圖7 PNU通過激活PI3K/Akt信號通路而抑制β-淀粉樣蛋白的集聚

3 討 論

在中樞神經系統中星形膠質細胞數量最多而且參與重要的生理功能：防止神經元損傷、提供代謝、營養支持和調節突觸活動〔14〕。星形膠質細胞在Aβ聚集和沉積過程中具有雙重病理角色。一方面，激活的星形膠質細胞能夠通過大量分泌細胞因子，炎性因子和一氧化氮等神經毒性物質而導致AD腦內的神經炎癥發生〔15〕；另一方面，活化的星形膠質細胞也能夠表達與Aβ降解有關的酶，對Aβ進行有效地吞噬和降解〔16〕。基于以上事實，促進星形膠質細胞對Aβ聚集和沉積的抑制功能可能成為治療 AD 的一個重要方向。

α7膽堿能受體是配體門控離子通道家族中的成員。它由五個跨膜亞基組成，有一個大的胞外氨基端，4個跨膜結構域和一個胞質域〔17，18〕。α7 nAChRs廣泛分布于大腦皮質和海馬的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞〔3〕。在 AD 的發病機制中，α7 nAChRs 通過與Aβ的相互作用而扮演了重要的病理角色〔4〕。近年來的研究表明，α7 nAChRs可能是拮抗Aβ神經毒性的一個重要靶點。在神經元細胞中，α7nAChRs能夠通過激活多條細胞內信號通路而拮抗 Aβ導致的神經細胞凋亡〔19〕。在前期結果中，用PNU處理星形膠質細胞后發現α7 nAChRs的表達上調，并且能顯著抑制Aβ聚集。本研究發現PNU通過激活α7nAChRs而上調Cryab蛋白水平，由此可推測PNU是通過激活星形膠質細胞的α7 nAChRs后上調內源性Cryab從而抑制Aβ的聚集。

PI3K/AKT 信號通路參與了α7 nAChRs的神經保護功能，在AD研究中發現，Akt在海馬神經元中表達減少，繼而導致神經元凋亡〔20〕。本實驗結果說明PNU激活α7 nAChRs后，使PI3K/Akt信號通路激活引起細胞內相應的效應。進一步的研究發現LY294002能抑制PNU上調內源性Cryab蛋白表達。這些結果表明，PNU通過α7 nAChRs上調星形膠質細胞內源性Cryab蛋白與PI3K/Akt信號通路的激活相關。上調Akt能對抗Aβ誘導的神經元凋亡和tau蛋白磷酸化〔21〕。PNU處理星形膠質細胞后能明顯抑制Aβ的聚集，并且該作用能被LY294002阻斷，說明PNU通過α7 nAChRs抑制Aβ聚集與PI3K/Akt信號通路的激活相關，而且該過程可能有內源性Cryab蛋白的參與。因為在AD大腦中，星形膠質細胞表達的Cryab蛋白明顯上調，并且這些上調的Cryab蛋白緊密地分布在Aβ蛋白沉積周圍〔7〕。Cryab蛋白能夠通過與Aβ蛋白直接結合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其細胞毒性作用〔8〕。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

PNU inhibiting Aβ aggregation via upregulation endogenous Cryab in rat astrocytes

REN Zhen-Kui,YANG Mei,GUAN Zhi-Zhong,et al.

Key Lab of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the possible mechanism of PNU on amyloid β (Aβ)aggregation via activation α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab.Methods Primary culture astrocytes were separated from neonatal SD rat cerebral cortex;Aβ1-42oligomers were prepared in vitro.Astrocytes were divided into control,PNU,MLA,Aβ1-42,PNU + Aβ1-42,PNU + LY294002 + Aβ1-42groups.The protein levels of Cryab,phosphorylated-Akt (ser473)and Aβ oligomers in the cells were detected by Western blot.Results (1)PNU significantly increased endogenous Cryab in astrocytes(P<0.05).The effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA (P<0.05).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation endogenous Cryab by PNU was significantly inhibited(P<0.01).(2)PNU significantly increased phosphorylated-Akt in astrocytes (P<0.05).The effect of up regulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited by α7 nAChR antagonist-MLA(P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of upregulation phosphorylated-Akt by PNU was significantly inhibited (P<0.01).(3)In cell lysis solution and medium,PNU significantly enhanced astrocyte to inhibit Aβ aggregation (P<0.01).After PI3K signaling pathway was blocked by LY294002,the effect of inhibition Aβ aggregation by PNU was significantly inhibited(P<0.01).Conclusions PNU could significantly inhibit Aβ aggregation via activated α7 nAChRs as well as upregulation endogenous Cryab in astrocytes.PI3K/Akt signaling pathway is likely to be invoved in this process.

Astrocytes;Alzheimer’s disease;α7nAChRs;PNU;αB-crystallin;β-amyloid

國家自然科學基金(81360199)；教育部科學技術研究項目(213032A)；貴州省國際科技合作計劃項目(黔科合外G字〔2013〕7026號)；貴州省教育廳項目(2015年貴州省普通高等學校地方病和少數民族疾病防控創新團隊)

禹文峰(1971-)，男，教授，主要從事神經分子生物學研究。

任真奎(1988-)，男，碩士，主要從事神經分子生物學研究。

R34

A

1005-9202(2016)22-5506-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.006