低劑量輻射通過誘導局部SDF1/CXCR4高表達促進大鼠糖尿病皮膚損傷愈合

張海峰 程艷麗 王洪莎 雷嫚嫚 魏 祺 郭蔚瑩

(吉林大學第一醫院介入治療科，吉林 長春 130021)

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低劑量輻射通過誘導局部SDF1/CXCR4高表達促進大鼠糖尿病皮膚損傷愈合

張海峰 程艷麗1王洪莎1雷嫚嫚1魏 祺1郭蔚瑩1

(吉林大學第一醫院介入治療科，吉林 長春 130021)

目的 探討低劑量輻射促進糖尿病(DM)皮膚損傷愈合的分子機制，明確SDF1、CXCR4在創面愈合過程中的作用。方法 制備DM皮膚損傷大鼠模型，分為2組，其中照射組(RDM組)給予75 mGy的X射線照射，6 min·次-1·d-1，照射5 d，間隔2 d，總共照射15 d。另一組為DM大鼠非照射組(DM)組；同時以正常大鼠皮膚損傷自然愈合為對照組(NDM組)。分別在創面愈合的7、14、21 d，通過創面愈合面積、免疫組化和蛋白印記方法觀察低劑量輻射對DM皮膚損傷創面愈合的影響，確定輻照對皮膚創面組織表達SDF1/CXCR4的調節作用。結果 DM大鼠創面存在難以愈合及愈合延遲的現象。RDM組大鼠的創面愈合率明顯高于未照射組(P<0.01)；免疫組化結果顯示DM組創面邊緣的SDF1和CXCR4蛋白表達明顯低于正常大鼠(P<0.01)，RDM組SDF1和CXCR4蛋白與DM組相比增加(P<0.01)；采用蛋白印記方法分析創面愈合過程SDF1/CXCR4的動態表達，結果顯示RDM組7 d SDF1表達與DM組相比增加2.8倍。關聯分析發現，SDF1表達強度與創面微血管密度密切相關。結論 低劑量輻射參與創面修復整個過程，通過誘導DM皮膚創面局部組織分泌大量的SDF1，招募外周血中EPCs，促進局部新生血管生成，加速創面愈合。

低劑量輻射；SDF1/CXCR4；糖尿病

糖尿病患者皮膚損傷后的愈合能力下降已經成為導致糖尿病患者致死致殘的重要原因之一。越來越多關于糖尿病及糖尿病慢性并發癥研究發現，糖尿病患者多伴有內皮祖細胞(EPC)數量減少以及功能不良，EPC功能受損可能在糖尿病血管并發癥的發生發展中扮演了重要的角色〔1〕。筆者前期工作發現，對于骨髓中內皮祖細胞，低劑量輻射能夠促進其從骨髓向外周血循環的動員，具有顯著的興奮性效應，可提高糖尿病創口的愈合效率，縮短愈合時間，促進創面的上皮化和促進膠原組織合成〔2〕。在皮膚創面愈合過程中，基質細胞衍生因子-1(SDF-1)及其特異性受體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸起重要作用。Akita等〔3〕將低氧環境下誘導的EPCs移植給免疫缺陷的裸鼠下肢，結果表明,移植EPCs的裸鼠缺血下肢有明顯血管新生。本研究通過對糖尿病大鼠皮膚創面的復制，應用免疫組織化學染色、蛋白印記方法，動態觀察低劑量輻射在糖尿病創面愈合過程對局部創面SDF1和CXCR4表達的影響。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備 Wistar大鼠購于吉林大學基礎醫學院動物中心，糖尿病大鼠模型制備采用50 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)行左下腹腔一次性注射。血糖達到16.7 mmol/L可判定為糖尿病造模成功。模型建立成功后繼續飼養8 w，制備皮膚損傷模型：2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去脊背部的毛，70%酒精清潔消毒，無菌條件下切除面積為9 cm2(直徑約3.4 cm)圓形皮膚，深達皮下組織全層的皮膚創口。將糖尿病大鼠隨機分為2組，75 mGy照射組(NDM)、糖尿病自然愈合組(DM)，以非糖尿病皮膚缺損模型為對照組(NDM)，每組24只。

1.2 照射條件及樣本收集 低劑量輻射的劑量為75 mGy，劑量率為12.5 mGy/min，每天照射6 min/次，連續照射5 d，休息2 d，共計照射15次。分別在照射后7 d、14 d和21 d時間點行創面照相，計算創面愈合率。然后取創面邊緣皮膚，部分10%的中性甲醛固定，石蠟包埋，部分取新鮮組織-80℃凍存。

1.3 免疫組化 采用SABC法，按試劑盒操作：石蠟切片脫蠟和水化后，0.01 mol/L的PBS洗滌3 min×3，置于檸檬酸緩沖液中92℃～95℃ 孵育20 min，修復抗原，室溫自然冷卻至37℃；加50 μl過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化酶活性，PBS沖洗3 min×3；切片加50 μl山羊血清，室溫下孵育10 min；除去血清，每張切片加50 μl第一抗體1∶100(兔抗-CD34，兔抗-SDF1，兔抗-CXCR4)；4℃孵育過夜。PBS沖洗3 min×3，加50 μl生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3 min×3；每張切片加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3 min×3；加入DAB溶液顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色均設有PBS(代替一抗)的陰性對照。結果判定采用KS400圖像分析系統(德國Kaiser公司)分析。

1.4 蛋白印記 新鮮保存的皮膚邊緣組織50 mg，剪碎，加入細胞裂解液500 μl，超聲破碎，12 000 r/min離心取上清，采用BCA法進行蛋白定量，樣品按4∶1加入5 ×上樣緩沖液,混勻后95℃10 min 變性。上樣行SDS-PAGE電泳：半干法電轉移凝膠上的蛋白帶至PVDF膜上，轉移后的PVDNF膜加5% 脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗SDF1或CXCR4(CST公司 1∶1 000)4℃孵育過夜,孵育后的PVDF膜經TBST洗膜3次,每次15 min，加入相應二抗(HRP標記羊抗兔IgG),稀釋濃度為1∶2 000，室溫孵育2 h，孵育后TBST洗膜3次，然后加入化學發光底物SuperSignal，暗室中行X光膠片曝光，顯影和定影，β-actin作為內參照。

1.5 結果觀察 創面愈合采用公式計算：愈合面積=初始創面面積-各時相點面積；創面愈合面積百分比=(愈合面積/初始創面面積)×100%。采用Adobe Image Ready7.0和Osiris軟件進行面積計算。創面微血管密度(MVD)計數：以抗CD34單克隆抗體標記顯示血管內皮細胞，孤立的棕黃色血管內皮細胞或細胞簇代表1條單獨的微血管。依據Pareek等〔4〕的方法，先在低倍視野內(×100)選擇CD34標記的MVD高的區域，然后在高倍視野內(×200)計數3個視野，取平均值作統計學處理。

2 結 果

2.1 低劑量輻射對DM大鼠創面愈合能力的影響 正常大鼠皮膚創面在21 d后基本愈合，DM大鼠的皮膚創面愈合能力顯著低于正常大鼠，愈合速度減慢，愈合時間延長。顯示合并DM大鼠傷口存在愈合能力下降及愈合速度延遲。RDM組大鼠的創面愈合率明顯高于未照射組(P<0.01)。照射后14 d，創面愈合差別最大。見表1，結果提示低劑量輻射有促進DM皮膚損傷愈合的作用。

表1 不同時間點各組大鼠愈合面積比較±s，n=8，cm2)

RDM組與DM組比較：1)P<0.01；NDM組與DM組比較：2)P<0.05；表2同

2.2 低劑量輻射對DM大鼠皮膚創面邊緣SDF1/CXCR4蛋白表達的影響 CXCR4定位于皮下間質區域的細胞，陽性表達為褐色。定量分析顯示，DM組創面邊緣的SDF1和CXCR4蛋白表達明顯低于NDM組，且DM組SDF1陽性細胞分布區域較窄，見圖1。RDM組SDF1和CXCR4蛋白與DM組相比增加(P<0.05)。采用蛋白印記方法分析創面愈合過程中SDF1/CXCR4的動態表達，結果顯示，正常大鼠皮膚損傷后7 d SDF1表達到高峰，21 d降低，DM大鼠SDF1的變化趨勢與其相似，但表達較弱，照射后7 d SDF1表達與DM組相比增加2.8倍。見圖2。

圖1 SDF1、CXCR4在DM大鼠皮膚傷愈組織中的表達(14 d，Bar=50 μm)

1)DM組與NDM組比較：P<0.05;2)DM組與NDM組比較：P<0.01;3)RDM組與DM組比較：P<0.05圖2 SDF1、CXCR4在傷愈過程中的動態變化

2.3 低劑量輻射增加DM大鼠皮膚創面邊緣MVD 皮膚損傷后7 d，DM大鼠和正常大鼠損傷創面均有CD34陽性表達。隨照射時間的延長，正常大鼠的皮膚創面中CD34陽性細胞呈現逐漸增多趨勢，創面MVD增加，尤其是孤立的血管內皮細胞明顯增加。至創傷愈合第14天，NDM組大鼠皮膚創面可見大量毛細血管增生，CD34呈強陽性表達。DM組大鼠皮膚創面為較零星散在的毛細血管增生，RDM組大鼠皮膚創面毛細血管則增生明顯，MVD明顯增加，見圖3。定量分析顯示，DM各組大鼠皮膚創面MVD值在傷后7、14、21 d均明顯低于NDM組(P<0.01)。RDM組皮膚創面的MVD與DM組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點各組大鼠創面MVD(個/160 μm×160 μm)比較

RDM組與DM組比較：1)P<0.05；NDM組與DM組比較：2)P<0.01

2.4 皮膚創面邊緣組織MVD與SDF1/CXCR4蛋白表達的相關性分析 SDF1蛋白表達量與MVD值的變化呈現正直線相關(r=0.81，P<0.001)，即隨著SDF1蛋白表達量的增加，MVD值亦增加。CXCR4蛋白表達與MVD值變化呈正相關(r=0.48，P<0.01)，SDF1與創面MVD關系更為密切。

圖3 CD34在糖尿病大鼠皮膚傷愈組織中的表達(14 d，Bar=50 μm)

3 討 論

糖尿病患者由于容易糖代謝，脂代謝及蛋白質代謝紊亂最終可引起血管內皮功能的異常，因此糖尿病患者一旦形成皮膚傷口，就面臨著傷口的愈合能力下降及愈合時間延長問題〔5〕。文獻報道，與非DM患者不同，2型糖尿病(T2DM)患者外周血液循環中EPCs的總體數量及功能均有不同〔1〕。DM越嚴重，則外周血循環中EPCs數量越少，二者呈明顯負相關。低水平的外周血循環EPCs可能與內皮細胞的功能失調及新生毛細血管形成能力下降，側支循環建立不良有密切的關系，因此EPCs在DM早期慢性并發癥的發病機制中起著重要作用。筆者前期工作中發現，低劑量輻照合并皮膚受損的DM大鼠，創面平均愈合率明顯高于單純DM自然愈合組；流式細胞術檢測骨髓和外周血中EPCs 數量，發現經LDR處理過得EPCs，無論是在骨髓中的增殖，還是向周圍血循環中動員、遷移的能力均有顯著性增加。因此，外周血循環中內皮祖細胞的數量明顯增多，活性明顯增強，參與促進血管再生和損傷血管的再內皮化〔2〕。充足歸巢是EPCs發揮生物學功能，促進新生血管形成和損傷修復的關鍵環節。蛋白酶、細胞內信號傳導、細胞黏附分子和多種趨化因子、趨化因子受體的共同作用最終決定了歸巢位點激活新生血管形成這一復雜的生物學過程〔5〕。在本實驗中筆者發現，75 mGy的X射線全身輻照局部皮膚受損的DM大鼠，其創面愈合率顯著高于未干預DM組；低劑量輻射能夠增加創面局部組織CD34陽性細胞數目和表達強度，促進局部微血管生成。結合前期工作發現LDR 促進骨髓EPCs動員和遷移，筆者推測LDR 促進DM皮膚損傷愈合可能與EPCs動員和創面局部對循環中EPCs招募密切相關。EPC可定向歸巢到血管內皮細胞損傷部位或缺血組織，從而參與新生血管生成和修復，但何種機制促發了EPC歸巢的始動信號，目前了解得很不全面。Hur等〔6〕通過在創面轉染Akt基因，結果表明，EPC的定向歸巢以及局部組織修復和新生血管重建的能力均明顯提高，認為Akt信號途徑在EPC的歸巢機制中具有重要的作用。在創面愈合過程中，SDF-1及其受體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸在造血祖細胞的動員、遷移及歸巢過程中也發揮著重要作用〔7～9〕。EPCs細胞表達CXCR4蛋白，SDF-1通過結合CXCR4介導EPCs向缺血、缺氧及血管損傷區的歸巢，SDF-1或CXCR4的阻斷均可抑制祖細胞向缺血區或損傷區的歸巢〔10，11〕。本文結果顯示，DM組SDF-1/CXCR4蛋白表達較低，分布在皮下狹窄區域的間質細胞；局部SDF-1增高是低劑量輻射促進創面血管生成，加快創面愈合的主要因素。

Bermudez等〔12〕研究發現，在創面愈合過程中內皮細胞和成纖維細胞是分泌SDF-1的首要細胞。SDF-1的分泌數量直接決定了成纖維細胞的增殖活性高低，二者密切相關，且能夠顯著調控創面的愈合能力。本研究結果表明低劑量輻射參與創面修復整個過程，通過增加骨髓動員至外周的EPCs細胞，誘導糖尿病皮膚創面局部組織分泌大量的SDF1，招募外周血中EPCs，促進局部新生血管生成，加速創面愈合。同時成纖維細胞分泌的SDF1可促進細胞增生，修復創面。同樣，在創面愈合的晚期，由于SDF-1分泌數量明顯下降，成纖維細胞的增殖效應不再明顯，同時伴有基質細胞的合成能力減弱，數量明顯減少，由富含成纖維細胞的肉芽組織衍化為瘢痕組織，因此愈合的速度明顯下降。

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3 Akita T，Murohara T，Ikeda H，etal.Hypoxic preconditioning augments efficacy of human endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization〔J〕.Lab Invest，2003;83：65-73.

4 Pareek G，Shevchuk M，Armenakas NA，etal.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density：a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients〔J〕.J Urol，2003;169：20-3.

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6 Hur J，Yoon CH，Lee CS，etal.Akt is a key modulator of endothelial progenitor cell trafficking in ischemic muscle〔J〕.Stem Cells，2007;25：1769-78.

7 Petit I，Jin D，Rafii S.The SDF-1/CXCR4 signaling pathway：a molecular hub modulating neo-angiogenesis〔J〕.Trends Immunol，2007;28：299-307.

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12 Bermudez DM，Xu J，Herdrich BJ，etal.Inhibition of stromal cell-derived factor-1α further impairs diabetic wound healing〔J〕.J Vasc Surg,2011;53(3)：774-84.

〔2016-06-09修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學基金(81300660)；吉林省發改委資助項目(2013C029-3)；吉林省科技廳白求恩專項(20160101035JC)；吉林省自然科學基金資助(2016010135JC)

郭蔚瑩(1974-)，女，副教授，主要從事內分泌代謝學研究。

張海峰(1975-)，男，副教授，主要從事介入治療學研究。

R815；R587.2

A

1005-9202(2016)22-5512-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.008

1 吉林大學第一醫院內分泌代謝科