血清miR-96、miR-326在多發(fā)性硬化復發(fā)、緩解期表達水平的變化

葉勵超 蔡若蔚 黃玉婷 林若庭 陳繼興

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000)

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血清miR-96、miR-326在多發(fā)性硬化復發(fā)、緩解期表達水平的變化

葉勵超 蔡若蔚 黃玉婷1林若庭 陳繼興

(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000)

目的 探討血清miR-96、miR-326表達水平與緩解-復發(fā)型多發(fā)性硬化(RRMS)的關系并評價其臨床意義。方法 RRMS患者57例，其中復發(fā)期(急性期)組32例，緩解期組25例，正常對照組30例；用熒光定量PCR檢測血清miR-96，miR-326相對表達量。結(jié)果 與RRMS復發(fā)期組和正常對照組比較，緩解期組血清miR-96相對表達量明顯增高(P<0.001)；與RRMS緩解期組和正常對照組比較，復發(fā)期組血清miR-326相對表達量明顯增高(P<0.001)。RRMS緩解期組血清miR-96相對表達量與擴大的殘疾功能狀態(tài)評分(EDSS)無相關性(r=0.22，P=0.30)，RRMS復發(fā)期組血清miR-326相對表達量與EDSS評分無相關性(r=-0.18，P=0.31)。結(jié)論 血清miR-96、miR-326與RRMS的炎癥活動密切相關，可作為監(jiān)測RRMS活動性的候選生物標記物。

多發(fā)性硬化；微小RNA；miR-96；miR-326

多發(fā)性硬化(MS)是一種自身免疫性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)受累為主，臨床特點是病灶的空間多發(fā)性和時間多發(fā)性。復發(fā)緩解型(RR)是MS最常見的類型，以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀急性加重，伴完全或不完全緩解為特征。由于MS致病原因仍不清楚，臨床表現(xiàn)多樣及治療反應不一，因此，各國學者都期待找出一種或幾種可靠的生物學標志物，能夠有助于監(jiān)測 MS的病情進展及反映 MS 對于治療的效果，但結(jié)果卻不盡如人意〔1〕。微小RNA(miRNA)是一類長度21～25個核苷酸的非編碼小分子組成的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，參與人類生命活動及疾病進程的調(diào)控，例如細胞增殖、發(fā)育、分化、代謝、凋亡、血管生成、炎癥和免疫〔2〕。miRNA表達和功能異常與癌癥、神經(jīng)變性和自身免疫疾病有關。在MS患者的病灶、血液、腦脊液及外周血單個核細胞中發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達異常，提示其參與了MS的病理生理過程〔3～6〕。本研究通過檢測RRMS患者復發(fā)期與緩解期血清miR-96與miR-326表達水平，探討其與MS炎癥活動的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2015年7月我院神經(jīng)內(nèi)科確診RRMS 57例，排除合并肝腎疾病、腫瘤、糖尿病、急性感染、心腦血管疾病及其他自身免疫性疾病患者。RRMS診斷參照2010年修訂的McDonald診斷標準〔7〕。RRMS復發(fā)期(急性期)組：32例，男9例，女23例；年齡21～60歲，平均(37.3±9.2)歲；病程10～98個月，平均(55.8±15.2)個月；擴大的殘疾功能狀態(tài)評分(EDSS)2.5～8.0分，平均(5.3±1.3)分。RRMS緩解期組：25例，男7例，女18例；年齡20～58歲，平均(38.4±7.9)歲；病程12～120個月，平均(60.4±18.6)個月；EDSS 1.0～7.0分，平均(3.1±1.2)分。正常對照組：健康體檢者30例，男8例，女22例；年齡18～60歲，平均(38.5±8.7)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法 兩組患者皆于清晨空腹抽取肘靜脈血2 ml，低溫快速離心，30 min內(nèi)分裝200 μl血清于凍存管中，-80℃保存。

1.2.1 純化miRNA和總RNA 將放于-80℃冰箱的血清樣本200 μl，放在冰上，標本融化后加入3倍體積的 Trizol LS (Invitrogen，美國)震蕩混勻，再加入0.5 ml氯仿震蕩混勻，置于低溫離心機，4℃以12 000 r/min 離心15 min，取上清，加入1.5 倍體積的無水乙醇，按照miRNeasy mini kit試劑盒(QIAGEN，德國)說明書步驟完成提取，獲得的RNA溶解于200 μl無 RNase雙蒸水中備用。

1.2.2 檢測miRNA 使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(TIANGEN，中國)分別進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。反應體系為20 μl，包括第一鏈合成cDNA、miRcute miRNA premix及引物(應用Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1)。反應條件：94℃預變性2 min；然后94℃ 20 s、60℃ 35 s，進行35～45個循環(huán)反應。以miR-16作為內(nèi)參。血清miR-96、miR-326 相對表達量計算公式為2-△△CT。每個樣品測定3次取平均值，同時做空白組以提高實驗可靠性。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS10.0軟件行Pearson檢驗。

表1 相關基因定量PCR 引物設計

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-96、miR-326的相對表達水平比較 與RRMS復發(fā)期組和正常對照組比較，緩解期組血清miR-96相對表達量明顯增高(P<0.001)。與RRMS緩解期組和正常對照組比較，復發(fā)期組血清miR-326相對表達量明顯增高(P<0.001)，見表2。

2.2 血清miR-96、miR-326相對表達量與RRMS嚴重程度相關性 RRMS緩解期組血清miR-96相對表達量與EDSS評分無相關性(r=0.22，P=0.30)，RRMS復發(fā)期組血清miR-326相對表達量與EDSS評分無相關性(r=-0.18，P=0.31)，見圖1和圖2。

表2 3組血清miR-96、miR-326相對表達量

圖1 RRMS緩解期組血清miR-96相對表達量與EDSS評分相關性

圖2 RRMS復發(fā)期組血清miR-326相對表達量與EDSS評分相關性

3 討 論

MS是一種免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘疾病，病因尚不明確，但CD4+T細胞在發(fā)病機制中扮演著至關重要的角色。表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達異常與MS等自身免疫性疾病存在明確關聯(lián)，MS發(fā)病過程中存在特異性miRNA 表達模式，miRNA通過影響巨噬細胞、T細胞和B細胞等免疫細胞的分化和激活調(diào)控免疫功能，這可能是導致MS發(fā)病的啟動因素〔8～12〕。許多miRNA在血液、腦脊液等體液中存在一定的表達豐度且理化特性穩(wěn)定，能夠作為疾病的生物標志物，循環(huán)miRNA 也因此成為MS研究的熱點〔13，14〕。國外學者通過檢測RRMS患者外周血單個核細胞miRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)100多種miRNA明顯表達異常，其中一部分是 MS 潛在生物學標志物〔15〕。

miR-96屬于miR-183家族成員，定位于人類染色體7q32。本研究與Otaegui等〔16〕研究結(jié)果一致，該團隊進一步利用基因處理工具尋找特異性miRNA 的靶基因及其可能參與的信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96調(diào)節(jié)的靶基因主要參與經(jīng)典免疫相關通路(如白細胞介素信號通路、Ⅰ組代謝型谷氨酸受體通路等)和 Wnt信號通路的調(diào)控。在MS發(fā)病過程中，前者參與谷氨酸介導的毒性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細胞的激活，后者參與效應T細胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)T細胞的活化。miR-96表達增加可以抑制相關靶基因轉(zhuǎn)錄后蛋白表達，從而干擾相關免疫通路，減輕MS炎癥反應〔17〕。因此，血清miR-96有可能作為RRMS緩解期的一種潛在生物標記物。

高表達的 miRNA-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物 Ets-1(一種調(diào)節(jié)Th17分化的負性因子)的表達，促進原始 CD4+T 細胞向 Th17 細胞的分化，加重 MS 患者病情。Du等〔18〕證實實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠外周血中Th17 細胞數(shù)目異常增高，并且與miRNA-326 表達水平呈正相關。RRMS復發(fā)期患者外周血淋巴細胞miRNA-326與miR-26a 表達水平明顯升高，根據(jù)ROC曲線分析，miR-326有近100%的敏感性和特異性鑒別RRMS復發(fā)與緩解〔19〕。因此，血清miRNA-326表達水平可以反映RRMS復發(fā)期炎癥活動情況。EDSS評分反映的是患者神經(jīng)功能缺損程度和日常生活能力，而血清miR-96、miR-326表達水平間接反映MS炎癥活動情況。但是Kacperska等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-92a表達水平與RRMS復發(fā)期患者EDSS評分存在負相關關系。綜上，血清miR-96、miR-326與RRMS的炎癥活動密切相關，可作為監(jiān)測RRMS活動性的候選生物標記物。

1 Bielekova B，Martin R.Development of biomarkers in multiple sclerosis〔J〕.Brain，2012；127：1463-78.

2 Li M，Marin-Muller C，Bharadwaj U，etal.MicroRNAs：control and loss of control in human physiology and disease〔J〕.World J Surg，2011；33：667-84.

3 Fenoglio C，Ridolfi E，Galimberti D，etal.MicroRNAs as active players in the pathogenesis of multiple sclerosis〔J〕.Int J Mol Sci，2012；13(10)：13227-39.

4 Keller A，Leidinger P，Steinmeyer F，etal.Comprehensive analysis of microRNA profiles in multiple sclerosis including next-generation sequencing〔J〕.Mult Scler，2014；20：295-303.

5 Sondergaard HB，Hesse D，Krakauer M，etal.Differential microRNA expression in blood in multiple sclerosis〔J〕.Mult Scler，2013；19：1849-57.

6 Martinelli-Boneschi F，F(xiàn)enoglio C，Brambilla P，etal.MicroRNA and mRNA expression profile screening in multiple sclerosis patients to unravel novel pathogenic steps and identify potential biomarkers〔J〕.Neurosci Lett，2012；508：4-8.

7 Polman CH，Reingold SC，Banwell B，etal.Diagnostic criteria for multiple sclerosis：2010 revisions to the McDonald criteria〔J〕.Ann Neurol，2011；69：292-302.

8 Zhang J，Cheng Y，Cui W，etal.MicroRNA-155 modulates Th1 and Th17 cell differentiation and is associated with multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.J Neuroimmunol，2013；266：56-63.

9 Chen F，Hu SJ.Effect of microRNA-34a in cell cycle，differentiation，and apoptosis：a review〔J〕.J Biochem Mol Toxicol，2012；26(2)：79-86.

10 Sievers C，Meira M，Hoffmann F，etal.Altered microRNA expression in B lymphocytes in multiple sclerosis：towards a better understanding of treatment effects〔J〕.Clin Immunol，2012；144：70-9.

11 Jernas M，Malmestrom C，Axelsson M，etal.MicroRNA regulate immune pathways in T-cells in multiple sclerosis (MS)〔J〕.BMC Immunol，2013；14：32.

12 Fenoglio C，Cantoni C，De Riz M，etal.Expression and genetic analysis of miRNAs involved in CD4+cell activation in patients with multiple sclerosis〔J〕.Neurosci Lett，2011；504：9-12.

13 Gandhi R，Healy B，Gholipour T，etal.Circulating microRNAs as biomarkers for disease staging in multiple sclerosis〔J〕.Ann Neurol，2013；73(6)：729-40.

14 Kacperska MJ，Jastrzebski K，Tomasik B，etal.Selected extracellular microRNA as potential biomarkers of multiple sclerosis activity-preliminary study〔J〕.J Mol Neurosci，2015；56(1)：154-63.

15 Keller A，Leidinger P，Lange J，etal.Multiple sclerosis：microRNA expression profiles accurately differentiate patients with relapsing-remitting disease from healthy controls〔J〕.PLoS One，2009；4：e7440.

16 Otaegui D，Baranzini SE，Armananzas R，etal.Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients〔J〕.PLoS One，2009；4：e6309.

17 Singh RP，Massachi I，Manickavel S，etal.The role of miRNA in inflammationand autoimmunity〔J〕.Autoimmun Rev，2013；12：1160-5.

18 Du C，Liu C，Kang J，etal.MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis〔J〕.Nat Immunol，2009；10：1252-9.

19 Honardoost MA，Kiani-Esfahani A，Ghaedi K，etal.miR-326 and miR-26a，two potential markers for diagnosis of relapse and remission phases in patient with relapsing-remitting multiple sclerosis〔J〕.Gene，2014；544 (2)：128-33.

〔2015-03-18修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省教育廳科技項目(No.JB13075);泉州市技術研究與開發(fā)項目(No.2015Z33)

葉勵超(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)免疫和腦血管病研究。

R774.6

A

1005-9202(2016)22-5519-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.011

1 檢驗科