疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對乳腺癌大鼠乳房微循環的影響

王玉祥 楊 潔 楊 超 王少青 張 辛 宋玉芝

(河北醫科大學第四醫院，河北 石家莊 050011)

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疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對乳腺癌大鼠乳房微循環的影響

王玉祥 楊 潔 楊 超 王少青1張 辛 宋玉芝

(河北醫科大學第四醫院，河北 石家莊 050011)

目的 觀察疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對乳腺癌大鼠乳房微循環的影響。方法 將形成滿意腫瘤結節的乳腺癌大鼠隨機分為乳腺癌組、紫杉醇組、小劑量疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇組(小劑量聯合組)和大劑量疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇組(大劑量聯合組)，將同期健康大鼠作為對照組。給予紫杉醇組尾靜脈注射紫杉醇(劑量25 μg/g)，小劑量聯合組在紫杉醇組基礎上給予10 ml/kg疏肝化痰祛瘀方湯劑灌胃，大劑量聯合組在紫杉醇組基礎上給予(20 ml/kg)疏肝化痰祛瘀方湯劑灌胃，對照組尾靜脈及灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，所有組別連續給藥4 w。檢測體重、微循環灌注量、血液黏稠度和乳房組織中血管內皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)水平。結果 與對照組比較，乳腺癌組的體重與微循環灌注量明顯降低(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯增加(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯合組的體重與微循環灌注量顯著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯合組的體重與微循環灌注量顯著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明顯降低(P<0.05)。結論 疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對乳腺癌大鼠具有一定的治療效果，與改善乳房微循環、血流黏稠度和乳腺組織的VEGF和bFGF表達有關。

疏肝化痰祛瘀方；紫杉醇；乳腺癌；乳房微循環

乳腺癌在中醫領域屬于“乳巖”的范疇，其病機在“瘀”和“痰”兩方面〔1，2〕，其一：肝郁致使氣機運行不暢，氣機郁滯，氣滯血瘀，其二，肝郁克脾，脾不健運，水濕聚而為痰?？梢姟梆觥焙汀疤怠笔侨橄侔┑牟±懋a物，可見消除病理產物可能是乳腺癌的治療途徑之一。疏肝化痰祛瘀方是臨床治療乳腺癌的常用方劑，也獲得了較好的效果，但其治療機制至今仍未有研究。本研究觀察疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對乳腺癌大鼠乳房微循環的影響。

1 資料與方法

1.1 受試動物 選擇健康沒有生育史的雌性SD大鼠，體重180～220 g，購于浙江省試驗動物中心，生產許可證號：SCXK(浙)2003-0001。12 h日光燈照明，自由飲水攝食，常規飼養7 d后開始實驗。

1.2 Walker-256腫瘤細胞 Walker-256腫瘤細胞購于美國ScienCell研究實驗室，應用常規1640培養基培養，置于5%CO2培養箱37℃中培養。在指數增長期消化收集待用。

1.3 受試藥品 紫杉醇購自美國Sigma公司，二甲基苯蒽(DMBA，Sigma公司，批號：087K1196，規格：5 g/瓶)；疏肝化痰祛瘀方：當歸、川芎、青皮、醋制香附、桃仁、紅花、浙貝母和白芥子各12 g、半夏和蒼術各10 g，皂角刺20 g、陳皮6 g，加水1 L，煎至100 ml。疏肝化痰祛瘀方各味藥均購自市中藥材批發市場，由齊惠珍教授鑒別為真品。兔抗鼠VEGF抗體和和兔抗鼠bFGF抗體均購自美國Millipore公司。

1.4 試驗儀器 IEC601-1型激光多普勒微循環分析儀及配套LAB Measurement Statistics軟件系統(英國Moor公司)；FASCO型全自動血液流變快測儀(重慶大學維多研究所)；BX50-3E01型光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM-2235型石蠟切片機(德國徠卡公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 乳腺癌大鼠的制備 參照相關文獻〔3〕，構建乳腺癌大鼠模型。Walker-256腫瘤細胞單次接種在大鼠左側腋下，將死亡或未形成滿意腫瘤結節淘汰，成功率約60%。

1.5.2 分組和給藥 將形成滿意腫瘤結節的乳腺癌大鼠隨機分為乳腺癌組，紫杉醇組，小劑量疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇組(小劑量聯合組)和大劑量疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇組(大劑量聯合組)，每組12只，將同期健康大鼠作為對照組。給予紫杉醇組尾靜脈注射紫杉醇(劑量25 μg/g)，小劑量聯合組在紫杉醇組基礎上每日給予疏肝化痰祛瘀方湯劑按鼠體重10 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次；大劑量聯合組每日給予疏肝化痰祛瘀方湯劑按鼠體重20 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次。對照組給予尾靜脈及灌胃注射0.9%氯化鈉溶液，所有組別連續給藥4 w。

1.5.3 指標檢測

1.5.3.1 乳房微循環灌注量 給藥結束前1 d，除去大鼠胸部鼠毛，第二天，麻醉大鼠，激光探頭置于大鼠腋前第5對乳房，測試大鼠乳腺微循環的灌注量。

1.5.3.2 血液流變學 取大鼠下腔靜脈血5 ml靜脈血，注入肝素抗凝，檢測血液流變學參數。

1.5.3.3 乳房組織中血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)水平 給藥結束后，處死大鼠，在無菌條件下，取大鼠胸部左側第2只乳腺和周圍皮膚約1.5 cm×1.5 cm，用甲醛固定，石蠟包埋，切片。石蠟切片水化，用PBS液沖洗，切片加過氧化氫溶液孵育10 min，PBS沖，加EDTA高壓熱修復2 min，切片再加—抗，室溫孵育60 min，PBS 沖洗，切片再加聚合物增強劑，室溫下孵育，PBS 沖洗，加50酶標鼠/兔聚合物，室溫孵育，PBS 沖洗，再加DAB顯色液，陰性對照采用PBS液代替一抗，鏡下觀察，陽性顯色為棕色。用尼康NIS-Element BR3.1圖像分析系統，每份樣本隨機選5個視野，將視野中的陽性細胞面積與總面積的比值作為VEGF和bFGF的表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行Mann-WhitneyU檢驗或Fisher精確檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠的一般情況比較 乳腺癌組大鼠反應遲緩、皮毛松弛，暗淡無光、蜷縮少動、對刺激敏感度降低和飲食水量減少。紫杉醇組皮毛松弛，毛發暗淡、倦怠淡漠、對刺激敏感度降低。小劑量和大劑量聯合組趨向正常。實驗中乳腺癌組大鼠死亡3只，紫杉醇組死亡2只，大劑量聯合組死亡1只，小劑量聯合組死亡2只。

2.2 各組大鼠的腫瘤發生比較 與對照組比較，乳腺癌組的腫瘤個數明顯增高(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯合組的腫瘤個數顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠的體重和乳房微循環灌注量的比較 與對照組比較，乳腺癌組的體重與微循環灌注量明顯降低(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量和大劑量聯合組的體重與微循環灌注量顯著增高(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯合組的體重與微循環灌注量顯著增高(P<0.05)，見表2。

2.4 各組大鼠的血液流變學參數的比較 與對照組比較，乳腺癌組的血液黏稠度明顯增加(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量聯合組和大劑量聯合組的血液黏稠度明顯降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯合組的血液黏稠度顯著降低(P<0.05)，見表3。

表1 各組大鼠的腫瘤發生比較

與對照組比較：1)P<0.05；與乳腺癌組比較：2)P<0.05

表2 各組大鼠的體重乳房微循環灌注量的比較±s)

與對照組比較：1)P<0.05;與乳腺癌組比較：2)P<0.05;與紫杉醇組比較：3)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠血液流變學參數的對比±s,mPa·s)

2.5 各組大鼠乳腺組織VEGF和bFGF水平的比較 與對照組比較，乳腺癌組的VEGF和bFGF水平顯著增高(P<0.05)，與乳腺癌組比較，紫杉醇組、小劑量聯合組和大劑量聯合組的VEGF和bFGF顯著降低(P<0.05)，與紫杉醇組比較，大劑量聯合組的VEGF和bFGF顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠乳腺組織VEGF和bFGF水平的比較±s，陽性細胞面積/總面積)

3 討 論

乳腺癌發病因素復雜，確切病因未知，但目前多認為其是環境和遺傳因素等多種因素，如遺傳，絕經年齡，內分泌，月經情況，生育情況，性生活，吸煙飲食等多種因素共同作用導致。在乳腺癌的治療中，手術治療仍是最主要的手段，臨床中多采用手術為主輔助放化療及其他內分泌治療的模式。然后多種治療方法均存在弊端及多種并發癥及毒副作用，在這種情況下，中醫治療以其獨特的優勢得以體現。

從中醫學理論看，肝主疏泄、主藏血，可調暢氣機，促進氣血運行，脾主運化水濕，水為生痰之源。乳腺癌的病機在于肝疏泄功能失調，氣機郁滯，影響氣血運行，氣行則血行，氣滯則血瘀，形成瘀血證；肝木乘脾，水濕不運，積而成痰；肝失疏泄，氣機阻滯，水濕氣化蒸騰障礙，津液輸布受阻成痰成飲，肝氣郁滯，痰瘀乃成。痰瘀既成又互相轉化，互為因果，痰積日久，阻遏氣機運行，可加重瘀血，二者交錯互阻致瘀滯，痰和瘀需聯合治之，治痰則瘀不去，逐瘀則痰不消。疏肝化痰祛瘀方中的青皮和香附具有疏肝行氣之效，當歸、川芎、桃仁、紅花和穿山甲皆有活血化瘀功效，三棱、莪術、皂角刺與路路通行氣活血，備穿透之力，輔以半夏、浙貝母、白芥子和海藻輔助化痰軟堅散結，諸藥合用，可達治痰去瘀和氣暢痰消之功〔4～6〕。本研究結果顯示，疏肝化痰祛瘀方可明顯改善乳腺癌大鼠的反應，皮毛的光澤度和飲食飲水量，提示疏肝化痰祛瘀方可調節乳腺癌所致的肝血不暢，水濕停滯和痰瘀阻滯，在改善乳腺癌的臨床癥狀具有明顯的優勢。

乳腺組織微循環障礙是乳腺癌病變的集中體現，多種因素均可以導致乳腺組織微循環障礙，研究表明〔7〕與以下因素有關：①從血流動力學范疇看，血液黏稠度的增加可導致循環阻力的增高。本文結果證明乳腺癌大鼠乳腺的血液黏稠度均明顯增高，而給予干預后大鼠乳腺的血液黏稠度指標均明顯降低。②從分子生物學角度看，乳腺組織VEGF和bFGF表達增加可加重乳腺組織微循環障礙。病理條件下，VEGF常呈現異常表達，腫瘤細胞可刺激 VEGF 表達上調，上調的VEGF可與其受體作用使腫瘤血管內皮細胞異常增殖、遷移，促進新生血管形成，同時血管通透性的增加，為腫瘤生長、侵襲和轉提供營養。腫瘤細胞可誘導血管內皮細胞產生 bFGF 作為血管誘生劑，bFGF 在乳腺組織中陽性表達率超過68%。VEGF 與bFGF兩者在血管生成中呈協同作用：VEGF及VEGF受體表達受到 bFGF 調控，bFGF可誘導 VEGF 的合成，還可上調VEGF 受體 FLK-1表達。腫瘤必須構建自己的血管系統，通過新生血管提供氧氣、養料并及時清除代謝產物才能夠持續性生長和發展。如果沒有血管系統提供氧氣和養料，實體瘤的體積增長難以超過1 mm3〔8〕?？梢奦EGF 與bFGF的表達水平與腫瘤惡性程度及預后緊密相關。本文結果顯示，給予乳腺癌大鼠以疏肝化痰祛瘀方可明顯改善乳腺組織的微循環，可能與降低血液高黏狀態和降低乳腺組織VEGF和bFGF表達相關，這兩種作用應與疏肝化痰祛瘀方的組成密切相關：①疏肝化痰祛瘀方具有化痰祛瘀和通竅止痛的功效，可明顯改善偏頭痛患者的血液流變學指標〔9〕；②祛瘀化痰法具有抗肺癌轉移的作用，其機制在于影響肺癌細胞的VEGF和CD44等蛋白合成和基因轉錄水平的表達，影響腫瘤血管的生成，達到影響腫瘤細胞增殖、黏附、遷移和侵襲的目的〔10〕。桃仁和紅花作為破血藥，體外試驗顯示破血藥可降低VEGF和bFGF蛋白表達〔11〕，川芎中的川芎嗪可通過降低VEGF和bFGF表達抑制胃癌新生血管生成〔12〕。目前對桃仁調節VEGF表達的趨向仍存在爭議，如以敏〔13〕研究認為桃仁可以降低VEGF表達，但只能降低熱證的VEGF，不能降低寒證的VEGF，原因不明，而乳腺癌患者以寒證明顯〔14〕，如果該研究結果確鑿，那么桃仁升高乳腺癌組織VEGF作用可能被紅花和川芎的作用所掩蓋了。

本文的不足處：①疏肝化痰祛瘀方的有效成分比較復雜，包含了當歸、川芎和青皮等12味藥，藥物來源不同，煎煮時間，煎煮溫度和器皿等不同均可不同程度影響療效，因此難以進行質量控制和商品化，一定程度地抑制了該方的標準化開發；②疏肝化痰祛瘀方中的當歸和川芎不僅是活血的主要成分，而且具有補血的效果，疏肝化痰祛瘀方兩者比例為1∶1，有研究〔15〕認為兩者比例1∶1.5在補血方面具有明顯的效果，疏肝化痰祛瘀方的活血藥物較多，因此活血功效明顯，補血相對不足，是否有必要調整當歸和川芎比例，還有待于進一步的考察；③疏肝化痰祛瘀方含有桃仁和紅花等破血藥，因為桃仁和紅花的安全性不足，但乳腺癌是一種特殊的疾病，長期服用利大于弊還是弊大于利，還需要再納入長期毒性研究驗證和觀察。

綜上所述，疏肝化痰祛瘀方聯用紫杉醇對大鼠乳腺癌具有一定的治療效果，可顯著改善乳腺癌的乳腺組織微循環，與降低血流黏稠度和降低乳腺組織的VEGF和bFGF表達有關。

1 鄭 瑩，吳春曉，張敏璐.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(8)：561-9.

2 戚益銘，沈敏鶴，阮善明，等.乳腺癌病因病機及中醫證治的研究進展〔J〕.黑龍江中醫藥，2014；43(5)：81-4.

3 鄧衛芳.乳腺癌癌前病變毒瘀互結大鼠模型的建立及解毒化瘀法干預研究〔D〕.北京：北京中醫藥大學，2013.

4 金 惠，王水英，孫 宇，等.中藥聯合放化療藥物治療乳腺癌的作用及其機制研究進展〔J〕.中國藥師，2013；16(5)：751-5.

5 薛秀娟，吳中秋，吳 頌.運用疏肝解郁養心化痰祛瘀法治療軀體化障礙的探討〔J〕.河北中醫，2012；34(2)：280-3.

6 宋 俊，張濱農，唐榮芳，等.疏肝健脾化痰祛瘀中藥配合針灸對代謝綜合征的影響〔J〕.遼寧中醫雜志，2012；55(8)：1545-6.

7 王翠珍，馬立敏，李 晶，等.涼血解毒膏加護理干預對預防乳腺癌術后放射性皮炎的影響〔J〕.河北醫藥，2011；33(23)：3674-5.

8 崔玉梅，宋飛翔，張雅潔.VEGF-A和VEGF-C在乳腺癌組織中的表達及意義〔J〕.中國現代藥物應用，2011；9(20)：277-8.

9 欒秀珍.化痰祛瘀方辨證治療偏頭痛(頭痛期)的臨床療效觀察〔D〕.濟南：山東中醫藥大學，2013.

10 姜 林.祛瘀化痰法抗肺癌轉移的分子機制研究〔D〕.武漢：湖北中醫藥大學，2012.

11 謝 輝，龍志江，朱久宜，等.活血、破血藥對急性腦缺血大鼠基底動脈內皮細胞VEGF和bFGF表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012；18(23)：183-6.

12 黃正華.川芎嗪抑制胃癌新生血管生成的細胞實驗研究〔D〕.廣州：廣州中醫藥大學，2006.

13 以 敏.桃仁改善不同病因所致血液循環障礙的藥效及相關分子機制研究〔D〕.南寧：廣西醫科大學，2012.

14 陳漢惠.乳腺癌的中醫證素研究〔D〕.福州：福建中醫藥大學，2012.

15 李偉霞.當歸-川芎藥對功效物質與配伍作用機理研究〔D〕.南京：南京中醫藥大學，2014.

〔2015-06-17修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

楊 潔(1982-)，女，在讀博士，副主任醫師，主要從事惡性腫瘤的放射治療研究。

王玉祥(1969-)，男，博士，主任醫師，主要從事惡性腫瘤的放射治療研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)22-5539-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.020

1 河北省隆堯縣醫院