趨化因子受體4調節PI3K/Akt和Erk信號通路促進卵巢癌SKOV3細胞上皮細胞-間充質轉化

孟巧絨 李 楠 閆 旭

(西藏民族大學附屬醫院婦產科，陜西 咸陽 712082)

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趨化因子受體4調節PI3K/Akt和Erk信號通路促進卵巢癌SKOV3細胞上皮細胞-間充質轉化

孟巧絨 李 楠1閆 旭2

(西藏民族大學附屬醫院婦產科，陜西 咸陽 712082)

目的 觀察趨化因子受體4(CXCR4)通過激活PI3K/Akt和Erk信號通路在卵巢癌SKOV3細胞上皮細胞-間充質轉化(EMT)中的作用。方法 Boyden小室檢測激活CXCR4后SKOV3細胞遷移和侵襲能力的變化情況。Western印跡方法檢測激活CXCR4后SKOV3細胞中EMT相關蛋白的表達情況及PI3K/Akt和Erk信號通路的活化情況。PI3K/Akt和Erk信號通路抑制劑預處理SKOV3細胞后，采用Western印跡方法檢測SKOV3細胞中EMT相關蛋白的表達情況。結果 同對照組相比，激活CXCR4后可促進SKOV3細胞的遷移和侵襲能力(P<0.01)，下調SKOV3細胞中與EMT相關的E-鈣黏蛋白表達，并上調EMT相關波形蛋白的表達。Western印跡結果顯示隨著CXCR4刺激時間的延長，SKOV3細胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐漸升高。采用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002和Erk信號通路抑制劑U0126預處理SKOV3細胞后，CXCR4介導的E-鈣黏蛋白表達下調和波形蛋白表達上調被阻斷。結論 CXCR4通過激活SKOV3細胞中的PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路，下調SKOV3細胞中E-鈣黏蛋白表達，并上調波形蛋白的表達，從而促進卵巢癌SKOV3細胞EMT的發生。

趨化因子受體4；信號通路；上皮細胞-間充質轉化；遷移；侵襲

趨化因子是指吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量的蛋白質〔1〕。多種趨化因子及相關受體參與了腫瘤細胞的浸潤和轉移，在腫瘤的發生發展中具有重要的作用〔2,3〕。趨化因子受體4(CXCR4)是趨化因子受體家族中重要的成員，與乳腺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺導管細胞癌和肝癌等的生長、浸潤和轉移密切相關〔4～8〕。而CXCR4在卵巢癌中的作用目前研究還很少。據此，本研究對CXCR4激活在誘導卵巢癌SKOV3細胞遷移和侵襲中的作用進行初步探討，并觀察CXCR4激活是否可通過調節PI3K/Akt和Erk信號通路活化而在卵巢癌SKOV3細胞上皮細胞-間充質轉化(EMT)中發揮一定的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 卵巢癌SKOV3細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。CXCR4激活所用CXCR4配體基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)購自Peprrotoech公司。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、p-Akt抗體和p-Erk1/2抗體購自Cell Signaling Technology公司；LY294002、U0126辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG購自Snata Cruz公司；100×蛋白酶磷酸酶抑制劑Cocktail 購自Thermo公司；Boyden小室購自Millpore公司。

1.2 細胞培養基處理 采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養卵巢癌SKOV3細胞，待細胞生長至對數生長期開始實驗。SKOV3細胞遷移和侵襲能力檢測實驗及EMT相關蛋白檢測實驗中，采用200 ng/ml的SDF-1α處理SKOV3細胞48 h。PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路活化檢測實驗中，采用200 ng/ml的SDF-1α處理SKOV3細胞0、5、10和20 min。PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路阻斷實驗中，分別于培養基中加入5 μmol/L的LY294002和30 μmol/L的U0126。

1.3 遷移和侵襲能力檢測 采用傷口愈合實驗分析CXCR4對卵巢癌SKOV3細胞遷移能力，具體操作方法參見文獻〔9〕。采用Boyden小室分析CXCR4對卵巢癌SKOV3細胞侵襲能力的影響，具體操作方法參見文獻〔10,11〕。

1.4 SKOV3細胞總蛋白提取 采用CytoBuster 蛋白提取試劑提取上述SDF-1α處理卵巢癌SKOV3細胞的總蛋白：采用預冷冰PBS洗滌細胞2次(400 r/min離心5 min)；棄盡細胞上清后加入適量蛋白酶磷酸酶抑制劑Cocktail和CytoBuster 蛋白提取試劑，渦旋混勻；室溫放置15 min；于預冷至4℃離心機中離心(12 000 r/min離心15 min)；吸取上清即為細胞總蛋白。

1.5 蛋白濃度檢測 嚴格按BCA試劑盒說明書操作：將試劑A和試劑B按50∶1的體積比混合配制成工作液；于酶標板中每孔加入200 μl的工作液，并加入25 μl倍比稀釋的標準品或待測樣品，每種檢測條件設置3個復孔。37℃避光孵育30 min；酶標儀在波長562 nm 處測定OD值；根據標準品的光密度值和濃度梯度繪制出標準曲線以推算出樣品濃度。

1.6 Western印跡方法 上述提取的細胞總蛋白經8% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，采用濕轉的方法將蛋白轉印至PVDF膜上。PVDF膜以含5% BSA的TBST室溫封閉2 h；加入相應的一抗4℃孵育過夜。第二天用0.1% TBST 洗膜3 次后加入相應種屬的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，PVDF膜以Supersignal West Pico HRP敏感化學發光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

1.7 統計學方法 采用SPSS15.0軟件行采用t檢驗。

2 結 果

2.1 CXCR4激活對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響 對照組、CXCR4刺激組的SKOV3細胞傷口寬度百分比分別為(1.00±0.00)和(0.34±0.15)，CXCR4刺激可顯著促進SKOV3細胞的遷移能力(P<0.01)。對照組、CXCR4刺激組的SKOV3細胞發生侵襲的細胞數分別為(156.85±41.95)和(318.56±58.93)，CXCR4刺激可顯著促進SKOV3細胞的侵襲能力(P<0.01)。見圖1。

2.2 CXCR4激活對SKOV3細胞EMT相關蛋白表達的影響 CXCR4刺激后可下調SKOV3細胞中與EMT相關的E-cadherin表達，并上調EMT相關波形蛋白Vimentin的表達。見圖2。

2.3 CXCR4激活對SKOV3細胞中PI3K/Akt和Erk信號通路活化的影響 隨著CXCR4刺激處理時間的延長，SKOV3細胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐漸升高。見圖3。

2.4 阻斷PI3K/Akt和Erk信號通路后SKOV3細胞EMT相關蛋白表達情況 阻斷SKOV3細胞中PI3K/Akt和Erk信號通路后，CXCR4介導的E-cadherin表達下調和Vimentin表達上調被阻斷。見圖4。

圖1 SKOV3細胞遷移(A)和侵襲能力(B)變化情況

圖2 SKOV3細胞E-cadherin和Vimentin表達情況

圖3 Western印跡檢測Akt和Erk磷酸化情況

圖4 SKOV3細胞E-cadherin和Vimentin表達情況

3 討 論

雖然卵巢癌對化療敏感，加之目前臨床多采用腫瘤根治術和鉑加紫杉醇為基礎的化療對卵巢癌進行治療，然而卵巢癌患者的預后仍不理想，且5年生存率僅為25%〔12〕。已知患者的臨床病理參數，如年齡、 腫瘤分期、 患者身體機能和殘余腫瘤體積為卵巢癌預后的獨立預測因子，然而，即便是狀態和治療相似的患者其生存率也不盡相同〔13〕。

CXCR4是一種G蛋白偶聯的趨化因子受體，通過與其相應的配體基質細胞衍生因子(SDF)-1α結合而發揮生物學效應〔14〕。CXCR4/SDF-1α軸在胚胎發育、 巨噬細胞遷移和分化中具有重要的作用〔13〕。一項研究分析了卵巢癌細胞中14種趨化因子受體的表達情況，結果顯示，卵巢癌細胞僅表達CXCR4〔15〕，提示CXCR4與卵巢癌的發生發展相關。同時，EMT與卵巢癌的發生和發展密切相關。那么，CXCR4是否可通過介導卵巢癌細胞EMT的發生而參與卵巢癌的發生和發展呢？本研究結果顯示，激活CXCR4可顯著上調SKOV3細胞的遷移和侵襲能力。CXCR4可通過激活SKOV3細胞中的PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路，下調SKOV3細胞中E-cadherin表達，并上調Vimentin的表達，從而促進卵巢癌SKOV3細胞EMT的發生，與文獻〔16〕報道的CXCR4發揮作用激活的下游信號通路結果一致。

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〔2015-11-12修回〕

(編輯 徐 杰)

孟巧絨(1978-)，女，碩士，主治醫師，講師，主要從事中西醫結合婦科研究。

R71

A

1005-9202(2016)22-5547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.023

1 陜西中醫藥大學附屬醫院婦科 2 吉林大學第一醫院病理科