晚期非小細胞肺癌自體T細胞過繼免疫治療后T細胞受體變化

馮 燕 呂曉鵬 黃京子 馮 剛

(吉化集團公司總醫院 北華大學第二附屬醫院腫瘤內科，吉林 吉林 132022)

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·腫 瘤·

晚期非小細胞肺癌自體T細胞過繼免疫治療后T細胞受體變化

馮 燕 呂曉鵬 黃京子 馮 剛1

(吉化集團公司總醫院 北華大學第二附屬醫院腫瘤內科，吉林 吉林 132022)

目的 探討肺癌患者經自體T細胞過繼在治療后T細胞受體(TCR)的變化特征及臨床意義。方法 用分子生物學方法對晚期非小細胞肺癌放化療結合細胞治療的患者，免疫細胞治療前和治療3個療程結束后檢測TCR表達的變化分析。結果 21例患者中的12例在CD4+TCR基因家族中產生克隆化改變，而這種改變發生在CD8+TCR基因家族有16例。結論 外周血TCR克隆化分析可能成為自體T細胞過繼免疫治療的療效評價指標。

肺癌；T細胞過繼免疫治療；T細胞受體

雖然近年自體T細胞過繼免疫治療技術取得了長足的發展，但由于缺乏客觀評價方法，導致體外培養的細胞不能被有效地質控監測，回輸至患者體內后療效又不能被準確和及時地評價，從而阻礙了這項新技術規范化與標準化的實施。本文擬通過觀察晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者接受自體T細胞過繼免疫治療前后T細胞受體(TCR)克隆化變化，探討肺癌患者自體T細胞過繼免疫治療后的療效。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年8月在我院接受化放療的晚期(NSCLC)患者43例，男32例，女11例，年齡48～76歲，中位年齡66歲，腺癌25例，鱗癌18例，卡氏評分(KPS)≥60分。所有病人治療前綜合免疫功能分析與評價，按照免疫功能分兩組，治療組21例，予化放療+細胞治療；對照組22例，予化放療。

1.2 治療方法 化、放療均按NCCN指南要求規范進行，化療：采用DP方案。放療：ⅢB期病人于化療前施行，采用CT模擬定位，以95%PTV作為處方劑量線，60 Gy/30次。細胞治療：于化療前采血，距前一個周期化療間隔2 w及以上，每例患者接受3個療程的細胞免疫治療，所有患者在接受自體T細胞過繼免疫治療前和3個療程結束后2 w進行T淋巴細胞亞群及TCRVβ 克隆化定性及定量檢測。

1.3 儀器設備及方法

1.3.1 外周血單個核細胞的分離 采集患者靜脈血80 ml，用聚蔗糖400(Lympholyte-H，Cedarlane產品)分離單個核細胞(PBMCs)，經生理鹽水洗滌細胞3次后備用。

1.3.2 DC細胞的分離及體外培養 PBMCs懸浮于DC培養基后，在培養皿內37℃ 貼壁培養3 h，懸浮細胞用于T細胞培養，貼壁細胞培養于DC培養基中并添加GM-CSF 1 000 U/ml和白細胞介素(IL)-4 1 000 U/ml，培養第4天添加相應腫瘤抗原提取物，培養第5天添加腫瘤壞死因子(TNF)-α1 ng/ml，培養第7天后對DC細胞表型(CD80/CD83/CD86/HLA-DR)進行檢測，微生物及內毒素檢驗合格后收集DC，按方案回輸至患者皮下。

1.3.3 T細胞的體外培養和擴增 將貼壁處理后的懸浮細胞用T細胞培養基懸浮并調細胞密度為2×106/ml，添加IL-2 1 000 U/ml、CD3McAb 50 ng/ml。此后每2 d計數細胞并適當補充新鮮培養基。分別在培養的第10、12、14天進行細胞表型、微生物及內毒素檢測，各項指標符合要求后收集T細胞、洗滌，按方案回輸至患者靜脈內。

1.3.4 細胞表型及淋巴細胞亞群分析 采用流式細胞術分析DC細胞及淋巴細胞表型，所有熒光標記的流式細胞抗體均購自美國BD公司，細胞表面標記分析和細胞內標記分析按說明書操作。

1.4 TCR多樣性分析 采集靜脈血5 ml，常規法分離PBMC，用磁珠法(invitrogen)分選CD4+和CD8+T細胞，分別提取總RNA (Qiangen)，將各總RNA按TCR檢測Kit(北京愛根生物科技公司)說明書分別進行RT-PCR和巢式PCR擴增，采用ABI3730 DNA 分析儀(美國ABI公司)分析擴增產物的長度多樣性，以GeneMapper軟件做可視化數據分析。

1.5 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行單因素分析。

2 結 果

2.1 臨床指標變化 治療組中位無進展生存(PFS)為6.8個月，明顯高于對照組4.5個月(P<0.05)。治療組1年生存率(85%)，明顯高于對照組(50%，P<0.05)。

2.2 T淋巴細胞亞群變化 治療組治療后總T淋巴細胞普遍升高，升高比率為76.2%，CD4+T淋巴細胞升高比率為71.4%，CD8+T淋巴細胞亞群比率升高者66.7%，與對照組比較均有統計學意義。

2.3 TCR Vβ表達變化

2.3.1 TCR Vβ多態性的恢復 在治療組21例患者中，14例病人TCR Vβ出現多態性的恢復，典型的TCRVβ多態性的恢復如圖1、圖2所示。

圖1 病人001接受自體T細胞過繼治療后TCRVβ多樣化漸變

2.3.2 TCR Vβ克隆化產生 12例CD4TCRVβ在治療后發生克隆化保持或漸變，其中67%(8/12)CD4TCRVβ克隆化發生在14、16亞家族，16例CD8TCRVβ在治療后發生克隆化保持或漸變，而75%(12/16)CD8TCRVβ克隆化發生在1、4、7、11、17亞家族。典型的TCRVβ克隆化漸變，見圖3、圖4。

圖2 病人002接受自體T細胞過繼治療后TCRVβ多樣化漸變

圖3 病人003接受自體T細胞過繼治療后TCRVβ克隆化漸變

圖4 病人004接受自體T細胞過繼治療后TCRVβ克隆化漸變

3 討 論

腫瘤的發生發展與免疫相關，但病人體內腫瘤的減小或消失，并不是簡單由T細胞的免疫活性高低或免疫應答反應的強弱來決定的，而與復雜的分子免疫學因素有關。多項最新研究發現：T細胞免疫治療引起人體內腫瘤的減小或消失的主要因素是克隆化的TCR。英國倫敦大學在2007年發表一篇綜述文章題為“單克隆T細胞受體基因：新的癌癥治療試劑”，此文章重點闡述了克隆化的TCR在免疫治療中的作用。美國西雅圖Fred Hutchinson 癌癥研究中心 2008年在新英格蘭醫學雜志 (NEMJ)發表了一篇“腫瘤自體免疫細胞治療”的文章指出，在T細胞免疫治療中起主導作用的是那些克隆化的T細胞。研究還發現，TCR克隆化的程度和這些克隆T細胞在病人體內存留的時間長短，也是免疫治療成敗的關鍵〔1〕。

TCR是T細胞表面識別并結合抗原的分子。95%的TCR 是由α和β多肽鏈組成的異二聚體〔2〕。TCR多樣性檢測技術是基于TCRβ鏈CDR3區序列長度的多態性，利用RT-PCR技術和GeneScan掃描技術從RNA水平研究TCRβ鏈CDR3(TCR Vβ)譜型進而分析T細胞克隆組分的方法，通過分析不同峰圖可以了解T細胞在不同疾病、同一種疾病的不同階段，或不同因素作用后克隆增生的動態變化趨勢。在正常人，TCR Vβ譜型多呈近似正態Gaussian分布，而在一些感染性疾病、自身免疫病及腫瘤等狀態下，由于抗原持續的刺激導致其TCRVβ譜型發生明顯變化〔3〕。本研究結果說明，自體T細胞過繼治療可以提高患者的腫瘤抗原特異性T細胞克隆化，而腫瘤抗原特異性T細胞克隆化增殖的程度越高患者的生存就越長〔4～7〕。另外，本研究中許多Vβ出現多樣化漸變，說明成功的免疫治療以后可引起TCR多態性的恢復，達到免疫重建的效果〔8，9〕。

過繼性免疫治療是腫瘤生物治療的方法之一。本研究結果提示，T淋巴細胞亞群比例以及TCRVβ克隆化、多樣化動態分析可以用于自體T細胞過繼免疫治療的多個環節，但只是對自體細胞免疫治療評價方法的初級體驗，如何確立和科學運用這些評價方法等還需深入研究。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省衛生計生委衛生科研課題立項計劃(2013Z085)

馮 剛(1960-)，男，副主任技師，主要從事腫瘤檢測技術研究。

馮 燕(1970-)，女，主任醫師，碩士，主要從事腫瘤內科治療及細胞免疫治療研究。

R730.3；R734.2

A

1005-9202(2016)22-5606-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.050

1 吉化集團公司總醫院 北華大學第二附屬醫院檢驗科