鼻咽癌組織中己糖激酶2的表達及臨床意義

劉 娜 翁閃凡 張曉林 陳 姝

(佛山科學技術(shù)學院，廣東 佛山 528000)

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鼻咽癌組織中己糖激酶2的表達及臨床意義

劉 娜 翁閃凡 張曉林 陳 姝1

(佛山科學技術(shù)學院，廣東 佛山 528000)

目的 探討己糖激酶2(HK-Ⅱ)在鼻咽癌組織中的表達水平及其臨床意義。方法 選擇鼻咽癌患者活檢組織25例作為觀察組，另取同期慢性鼻咽部炎癥患者活檢組織為對照組，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測兩組HK-Ⅱ mRNA的表達，采用免疫印跡法檢測兩組HK-Ⅱ蛋白表達。結(jié)果 觀察組HK-Ⅱ mRNA和蛋白表達均顯著高于對照組(P<0.05)。鼻咽癌組織中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；與年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 HK-Ⅱ的高度表達與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為鼻咽癌靶向治療的重要分子標志物。

鼻咽癌；己糖激酶2；靶向治療

鼻咽癌是一種多基因遺傳疾病，其發(fā)病與遺傳易感性、環(huán)境因素、飲食習慣等多種因素有關(guān)〔1〕。目前，鼻咽癌發(fā)病機制尚不清楚，且其解剖位置隱蔽、早期癥狀不典型，容易造成漏診、誤診，影響臨床治療。據(jù)報道〔2〕，鼻咽癌患者5年生存率僅為50%左右。不同病變程度的鼻咽癌患者放化療敏感性等方面存在差異，因此，篩選鼻咽癌早期診斷以及預后相關(guān)的分子標志物對其治療具有深遠意義。己糖激酶2(HK-Ⅱ)在腫瘤組織異常糖酵解過程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤細胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者〔3〕，與腫瘤細胞的增長、侵襲等密切相關(guān)。本研究探討HK-Ⅱ在鼻咽癌組織中的表達水平及其表達的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2015年11月本院收治鼻咽癌患25例，分別經(jīng)內(nèi)鏡取活檢組織作為觀察組；另選取同期我院20例慢性鼻咽部炎癥患者，取黏膜活檢組織為對照組。標本取出后即放入-75℃冰箱保存。觀察組男17例，女8例；年齡24～77〔平均(45.82±12.07)〕歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。對照組男15例，女5例；年齡22～74〔平均(44.10±13.51)〕歲。觀察組所有患者均未接受任何放化療治療，所有標本均經(jīng)病理學診斷為低分化鱗狀細胞癌。兩組患者性別和年齡等基線資料無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 組織中HK-Ⅱ mRNA表達檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測兩組HK-Ⅱ mRNA的表達。采用Trizol法提取組織中的總RNA。(1)取活檢組織50 mg放入勻漿器，加入1 ml Trizol勻漿。(2)將勻漿液移入EP管，靜置5 min。(3)加入0.2 ml氯仿，震搖15 s，靜置2～3 min。(4)4℃、12 000 r/min離心15 min。(5)將最上層無色液體移至另一EP管。(6)加入異丙醇500 μl，上下顛倒EP管，混勻液體，靜置10 min。(7)4℃、12 000 r/min離心15 min，去除上清液。(8)加75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min，去除上清液。(9)加無水乙醇1 ml洗滌沉淀，室溫下干燥5～10 min。(10)加入無菌焦碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解沉淀。

1.2.2 組織中HK-Ⅱ蛋白表達檢測 采用免疫印跡法：(1)蛋白提取：剪碎組織，加入裂解液，充分勻漿裂解，10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。(2)蛋白變性：按照4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，PCR儀99℃變性10 min，-75℃冰箱保存。(3)測定提取標本蛋白濃度：將試劑盒A液、B液混合成工作液配置蛋白標準品，加入96孔板，每孔2 μl，加PBS補足20 μl；所有孔均加入二喹啉甲醛(BCA)工作液200 μl，溫箱孵育；測定濃度、繪制蛋白標準曲線，計算蛋白濃度。(4)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應、化學發(fā)光、顯影、定影，用Image-Pro軟件掃描蛋白條帶OD值，HK-Ⅱ條帶/β-actin比值即為蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 兩組HK-Ⅱ mRNAⅡ和蛋白表達對比 觀察組HK-Ⅱ mRNA表達(0.61±0.04)和HK-Ⅱ蛋白表達(0.49±0.15)均顯著高于對照組(0.06±0.03、0.11±0.05)(t=51.030、10.837，P<0.05)。

2.2 鼻咽癌組織HK-Ⅱ表達與臨床因素的關(guān)系 鼻咽癌組織中HK-Ⅱ mRNA和蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；與年齡和性別無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 HK-Ⅱ表達與臨床因素的關(guān)系

3 討 論

鼻咽癌患者早期臨床表現(xiàn)不典型，就診時約60%的患者出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移，約20%出現(xiàn)腦神經(jīng)受累，在積極治療后，仍有20%～30%的患者病情得不到有效控制，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等〔4，5〕。HK催化葡萄糖為6-磷酸葡萄糖，是催化糖酵解過程的第一步關(guān)鍵酶，在正常組織中含量很少，主要分布在肌肉、脂肪組織和肺組織中。HK有四種亞型：HK-Ⅰ、HK-Ⅱ、HK-Ⅲ、HK-Ⅳ，在腫瘤組織中HK-Ⅱ表達最為活躍〔6〕。HK-Ⅱ通過催化糖酵解過程中的產(chǎn)物被腫瘤細胞利用，促進腫瘤的生長和侵襲。在Warburg效應研究中〔7〕，發(fā)現(xiàn)HK-Ⅱ與腫瘤細胞糖酵解水平密切相關(guān)。HK-Ⅱ成為腫瘤生長代謝中的分子干預靶點，可用于癌癥的分子靶向治療。Kwee等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，46.54%的肝細胞癌標本檢測到HK-Ⅱ陽性表達；彭國慶等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ表達與宮頸癌病變程度正向相關(guān)；Sato-Tadano等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移時HK-Ⅱ的生物活性及表達量均顯著增高。

HK-Ⅱ在腫瘤組織中的作用機制主要包括促進葡萄糖代謝和抑制腫瘤細胞凋亡兩個過程，HK-Ⅱ與線粒體外膜蛋白(VDAC)結(jié)合，形成線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ，能夠選擇性的利用線粒體產(chǎn)生的三磷酸腺苷(ATP)，促進腫瘤細胞的糖酵解過程。線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ參與線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔復合物(PTP)的構(gòu)建，能夠抑制促凋亡因子，阻止線粒體途徑誘導的凋亡，進而抑制腫瘤細胞的凋亡，包括腫瘤細胞的生長和增殖〔11〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ的高度表達與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細胞的侵襲能力有關(guān)，即高度表達的HK-Ⅱ能夠促進糖酵解，為腫瘤生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)；與相關(guān)研究結(jié)果一致〔12〕。且糖酵解產(chǎn)生的酸性代謝物能夠破壞正常細胞基質(zhì)進一步為腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲提供有利環(huán)境。HK-Ⅱ的表達在不同年齡和性別鼻咽癌患者間尚未表現(xiàn)出顯著性差異，有待進一步研究。

1 Xiao L,Hu ZY,Dong X,etal.Targeting epstein-barr virus oncoprotein LMP1-mediated glycolysis sensitizes nasopharyngeal carcinoma to radiation therapy〔J〕.Oncogene,2014;33(37):4568-78.

2 董 欣.鼻咽癌中糖酵解與脂肪酸β氧化異常活化的機制研究〔D〕.長沙：中南大學,2014.

3 陳麗霞.采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白〔D〕.桂林：廣西醫(yī)科大學,2009.

4 Deng Q,Yu X,Xiao L,etal.Neoalbaconol induces energy depletion and multiple cell death in cancer cells by targeting PDK1-PI3-K/Akt signaling pathway〔J〕.Cell Death Dis,2013;4:e804.

5 郝俊芳,楊新華,董 偉,等.鼻咽癌的個體化治療〔Z〕.山東省醫(yī)學科技三等獎,2012.

6 姜漢國.PI3K/AKT信號傳導通路與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究〔D〕.濟南：山東大學,2010.

7 魏 婷.下調(diào)N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V對鼻咽癌細胞CNB-2惡性生物學行為的影響〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學,2011.

8 Kwee SA,Hernandez B,Chan O,etal.Choline kinase alpha and hexokinase-2 protein expression in hepatocellular carcinoma:association with survival〔J〕.PLoS One,2012;7(10):e46591.

9 彭國慶,尹紅玲,田 焱,等.糖酵解限速酶HK-2與宮頸組織癌變的關(guān)系〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2010;26(9):941-2.

10 Sato-Tadano A,Suzuki T,Amari M,etal.Hexokinase II in breast carcinoma:a potent prognostic factor associated with hypoxia-inducible factor-1α and Ki-67〔J〕.Cancer Sci,2013;104(10):1380-8.

11 Shen YA,Wang CY,Hsieh YT,etal.Metabolic reprogramming orchestrates cancer stem cell properties in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cell Cycle,2015;14(1):86-98.

12 梁莉麗,孫 迪,宋海濤,等.局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF檢測及意義〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2015;15(3):510-3.

〔2015-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

2012年佛山市醫(yī)學類科技攻關(guān)項目(No.201208065)

張曉林(1960-)，男，碩士，副教授，主要從事重大疾病生化與分子機制方面的研究。

劉 娜(1978-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤能量代謝方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)22-5616-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.055

1 佛山市第一人民醫(yī)院臨床研究所