Treg/Th17細(xì)胞失衡對(duì)尿毒癥血液透析患者微炎癥因子及血管鈣化的影響

王莉華 侯晶晶 高永寧 王麗麗 申 磊

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液透析科，河北 石家莊 050000)

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Treg/Th17細(xì)胞失衡對(duì)尿毒癥血液透析患者微炎癥因子及血管鈣化的影響

王莉華 侯晶晶 高永寧 王麗麗 申 磊

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液透析科，河北 石家莊 050000)

目的 探討尿毒癥患者血液透析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)與輔助性T 細(xì)胞17(Th17)水平失衡對(duì)相關(guān)炎癥因子及血管鈣化因子的影響。方法 105例尿毒癥患者為受試對(duì)象，其中35例尿毒癥合并心血管病行血液透析的患者為觀察1組，33例尿毒癥行血液透析無心血管病的患者為觀察2組，37例尿毒癥無心血管病未行血液透析的患者為對(duì)照1組，另選取同期的30例正常健康體檢者作為對(duì)照2組。以流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)單個(gè)核細(xì)胞中Treg、Th17細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)單個(gè)核細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-6、IL-17等炎癥因子及血管鈣化因子中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)法檢測(cè)叉頭蛋白p3(Foxp3)、維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體γt信使RNA(ROR-γt mRNA)的表達(dá)。結(jié)果 觀察1組與對(duì)照2組相比，存在Treg/Th17細(xì)胞比例失衡、BMP-2異常分泌，主要表現(xiàn)為IL-6、IL-17水平和Foxp3、ROR-γt相對(duì)表達(dá)量升高，而IL-10水平、Foxp3/ROR-γt相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01)；同時(shí)，這一失衡在觀察1組、觀察2組及對(duì)照組1組中均存在(P<0.01)。結(jié)論 Treg/Th17細(xì)胞比例失衡將引起尿毒癥血液透析患者微炎癥因子水平異常，導(dǎo)致血管鈣化加劇。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；輔助性T細(xì)胞；尿毒癥；血液透析；微炎癥因子；血管鈣化因子

血液透析作為確保尿毒癥患者生存時(shí)間的重要治療措施，不僅能有效清除患者體內(nèi)毒素，還能有效控制并緩解尿毒癥相關(guān)并發(fā)癥，但其治療局限性仍不容忽視。既往資料顯示尿毒癥患者較正常人的生存質(zhì)量明顯較低，即使在血液透析治療后仍存在較高的并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率〔1〕。微炎癥狀態(tài)時(shí)體循環(huán)中炎性蛋白和細(xì)胞因子水平輕度增高，是導(dǎo)致機(jī)體并發(fā)癥慢性、低強(qiáng)度進(jìn)展的一種非顯性炎性狀態(tài)，這種狀態(tài)在臨床上并無顯著性表現(xiàn)〔2〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T 細(xì)胞17(Th17)分別是比較重要的抗炎性細(xì)胞、促炎性細(xì)胞，Treg/Th17細(xì)胞比例失衡在心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化中有促進(jìn)作用。血管鈣化是導(dǎo)致尿毒癥患者死亡的重要病理改變，同時(shí)也在血液透析患者致死和預(yù)后中作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素而存在〔3〕。本研究針對(duì)尿毒癥血液透析患者進(jìn)行研究，旨在分析Treg/Th17水平失衡對(duì)相關(guān)炎癥因子及血管鈣化因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將我院2013年1月至2015年5月收治的尿毒癥患者105例選為研究對(duì)象，全部尿毒癥患者均穩(wěn)定規(guī)律地接受透析治療，排除免疫性病變、進(jìn)展型肝病、惡性腫瘤、肝炎，且心瓣膜病變、血栓栓塞、彌散性血管凝血等患者和裝心臟起搏器者〔4〕。將其中尿毒癥合并心血管病行血液透析的35例患者分為觀察1組，尿毒癥行血液透析無心血管病的33例患者為觀察2組，尿毒癥無心血管病未行血液透析的37例患者為對(duì)照1組，另選取同期的正常健康體檢者30例作為對(duì)照2組。觀察1組男23例，女12例，平均年齡(56.4±9.2)歲；平均透析時(shí)間(29.8±19.2)個(gè)月，合并左室肥厚11例、不穩(wěn)定心絞痛5例、充血性心衰7例、心律失常14例。觀察2組男21例，女12例，平均年齡(48.5±10.1)歲；平均透析時(shí)間(30.1±16.5)個(gè)月。對(duì)照1組男24例，女13例，平均年齡(49.7±11.5)歲。對(duì)照2組男16例，女14例，平均年齡(48.6±10.6)歲。所有患者性別、平均年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者均對(duì)本研究知情，自愿參與并簽署知情同意書。

1.2 血液透析方案 患者上肢動(dòng)靜脈內(nèi)瘺行透析，血流量控制在200～250 ml/min，每次時(shí)間4～5 h，每周視病情透析2～3次，透析治療時(shí)間至少3個(gè)月。應(yīng)用聚砜膜透析器、碳酸氫鹽透析液，設(shè)置流量為500 ml/min。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集與外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 于患者入院清晨取空腹肘前靜脈血約20 ml裝入肝素抗凝試管內(nèi)，對(duì)白蛋白、血紅蛋白、血脂以及腎功能等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心將外周血中單個(gè)核細(xì)胞分離開來，以1640培養(yǎng)液配制為細(xì)胞懸液，濃度調(diào)整至3×106/ml，后取其上清液于零下80℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Treg、Th17水平檢測(cè) ①檢測(cè)Treg時(shí)，將CD4抗體和CD25抗體對(duì)細(xì)胞表面染色后，加入叉頭蛋白p3(Foxp3)抗體進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后再加PBS 200 μl重懸，完成后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。②檢測(cè)Th17時(shí)，在單個(gè)核細(xì)胞中加入CD4單抗置于4℃條件下培養(yǎng)20 min，根據(jù)操作說明進(jìn)行固定、透化處理后加入白細(xì)胞介素(IL)-17單抗進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照確保抗體特異性和有效補(bǔ)充。

1.3.3 IL-10、IL-6、IL-17、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2的檢測(cè) 采用ELISA法對(duì)提取的單個(gè)核細(xì)胞上清液中IL-10、IL-6、IL-17等炎癥因子及血管鈣化因子中的BMP-2進(jìn)行監(jiān)測(cè)，檢測(cè)試劑盒均由美國RD公司提供，所有試劑批內(nèi)分析、批間分析的變異系數(shù)均低于10%，所有樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 Foxp3、維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體γt(ROR-γt)mRNA的檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)法檢測(cè)Foxp3、ROR-γt mRNA表達(dá)，根據(jù)說明書應(yīng)用Trizol提取液(TaKaRa公司提供)提取總RNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，ROR-γt、Foxp3引物均由上海生工提供。PCR擴(kuò)增條件參數(shù)：94℃變性4 min，35個(gè)循環(huán)94℃變性20 s，60℃退火30 s、70℃延伸30 s，72℃時(shí)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)。Foxp3、ROR-γt mRNA均采用相對(duì)比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者Treg、Th17水平比較 Treg水平由高到低依次為觀察2組〔(6.05±1.77)〕、對(duì)照1組〔(5.93±3.28)%〕、觀察1組〔(5.06±2.39)%〕、對(duì)照2組〔(0.31±0.42)%〕，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=44.03，P<0.01)；Th17水平由高到低依次為觀察1組〔(36.32±9.73)%〕、對(duì)照1組〔(35.99±8.91)%〕、觀察2組〔(19.65±5.99)%〕、對(duì)照2組〔(1.13±1.01)%〕，組間比較差異顯著(F=162.11，P<0.01)；Treg/Th17由高到低依次為對(duì)照2組〔(26.33±2.28)%〕、觀察2組〔(21.24±10.26)%〕、對(duì)照1組〔(15.36±4.91)%〕、觀察1組〔(14.47±8.31)%〕，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(F=19.36，P<0.01)。

2.2 各組患者IL-10、IL-6、IL-17、BMP-2水平分析 IL-10水平由高到低依次為對(duì)照2組、觀察2組、對(duì)照1組、觀察1組(P<0.01)；IL-6由高到低依次為對(duì)照1組、觀察1組、觀察2組、對(duì)照2組(P<0.01)；IL-17由高到低依次為對(duì)照1組、觀察1組、觀察2組、對(duì)照2組(P<0.01)；BMP-2由高到低依次為對(duì)照1組、觀察1組、觀察2組、對(duì)照2組(P<0.01)。見表1。

表1 各組患者IL-10、IL-6、IL-17、BMP-2水平的比較

與對(duì)照2組比較：1)P<0.01；與對(duì)照組1組比較：2)P<0.01；與觀察2組比較：3)P<0.01,下表同

2.3 各組患者Foxp3、ROR-γt mRNA檢測(cè)情況分析 Foxp3 mRNA由高到低依次為觀察2組、觀察1組、對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.01)；ROR-γt mRNA由高到低依次為觀察1組、對(duì)照1組、觀察2組、對(duì)照2組(P<0.01)；Foxp3/ROR-γt由高到低依次為對(duì)照2組、觀察2組，觀察1組和對(duì)照1組相對(duì)表達(dá)量相當(dāng)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組患者Foxp3、ROR-γt mRNA水平比較

3 討 論

尿毒癥患者即使維持血液透析仍具有較高死亡率，主要是心血管相關(guān)并發(fā)癥所致〔5〕。血管鈣化和尿毒癥心血管并發(fā)癥的關(guān)系較為密切，是尿毒癥患者心血管病致死的重要病理變化，也是尿毒癥血液透析患者預(yù)后以及死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔6〕。目前認(rèn)為尿毒癥患者可能不僅發(fā)生了 Treg/Th17比例失衡，而且同時(shí)出現(xiàn)了比例失衡導(dǎo)致的血管鈣化。相關(guān)研究認(rèn)為〔7〕，單個(gè)核細(xì)胞作為重要的一種免疫性活性細(xì)胞，在受到刺激活化后能誘導(dǎo)相關(guān)非免疫細(xì)胞的功能變化，進(jìn)而出現(xiàn)加速性動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病等；而經(jīng)單個(gè)核細(xì)胞分離得到的Treg和Th17細(xì)胞比例失衡在多種感染性疾病、自身免疫性病變和急性冠脈綜合征中均有發(fā)生發(fā)展〔8〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥合并心血管病患者行血液透析期間存在明顯的Treg/Th17比例失衡現(xiàn)象，而血液透析有緩解炎癥的作用，可幫助改善患者Treg/Th17失衡。Treg與Th17均由相同前體細(xì)胞分化而成，但屬于兩種不同類型的細(xì)胞亞群，具有相互拮抗的分化方式、功能〔8〕。Treg細(xì)胞特異性表達(dá)Foxp3，具有分泌IL-10等抗炎因子發(fā)揮抑制炎癥、維持免疫耐受的效果〔9〕。Th17作為一種T細(xì)胞，具有較為強(qiáng)大的促炎性作用，主要通過分泌細(xì)胞因子IL-17等發(fā)揮其作用，特異性表達(dá)為ROR-γt〔10〕。尿毒癥患者普遍存在微炎癥反應(yīng)，IL-17和IL-6水平隨著Treg/Th17比例升高而降低，IL-10則隨著Treg/Th17比例升高而升高。血液透析能緩解尿毒癥病人的微炎癥狀態(tài)，且其療效較未透析患者更好〔11〕。BMP-2作為血管鈣化促動(dòng)劑，從胚胎的發(fā)育開始表達(dá)，是血管鈣化中關(guān)系最密切的一種蛋白〔12〕。研究顯示BMP-2注入肌肉組織能導(dǎo)致局部的異位鈣化〔13〕。同時(shí)，BMP-2也是心臟發(fā)育過程中的重要因子，可促使心臟內(nèi)心肌祖細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。本研究說明尿毒癥患者的BMP-2較正常健康者更高，且隨著Treg水平增加而降低，隨Th17水平增加而升高。

綜上所述，Treg/Th17細(xì)胞比例失衡導(dǎo)致尿毒癥血液透析患者微炎癥因子水平異常，導(dǎo)致血管鈣化加劇，為臨床治療尿毒癥患者血液透析期間心血管病的發(fā)生提供了思路。

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〔2015-12-13修回〕

(編輯 袁左鳴)

王莉華(1973-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事血液透析研究。

R692.5

A

1005-9202(2016)22-5691-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.091